植物内生真菌杀螺活性菌株筛选

韩邦兴,陈 钧,周晓坤,房伟伟,刘一丹,郝 蕾,牛成成

1江苏大学药学院,江苏镇江 212013;2植物细胞工程安徽省工程技术研究中心,六安 237012

植物内生真菌杀螺活性菌株筛选

韩邦兴1,2,陈 钧1＊,周晓坤1,房伟伟1,刘一丹1,郝 蕾1,牛成成1

1江苏大学药学院,江苏镇江 212013;2植物细胞工程安徽省工程技术研究中心,六安 237012

分别从醉鱼草和水菖蒲中分离出 99、103株内生真菌,按照WHO杀螺剂浸泡试验法观察不同内生真菌以及不同浓度发酵液杀螺效果,用河虾急性毒性试验评价其对非靶水生生物毒性。结果表明 LL3026、S38、S21菌株发酵液有较高的杀螺活性,发酵液浓度为 10%时,钉螺死亡率为 100.0%;对河虾急性毒性较小。

醉鱼草;水菖蒲;内生真菌;钉螺;杀螺活性

血吸虫病严重危害人类健康,钉螺是血吸虫的中间宿主。因此,消灭钉螺是控制血吸虫病传播的重要策略[1]。目前使用的化学灭螺剂对非靶生物,尤其是对鱼类有很大毒性,加之价格昂贵,从而限制其应用[2]。因此,进行生物灭螺方法研究及生物灭螺剂的开发,弥补化学杀螺剂的不足具有十分重要的意义。在此背景下,微生物灭螺剂筛选方兴未艾[3],并筛选出一些能有效杀灭钉螺的菌株[4-6]。

内生真菌(Endophytic fungus)是指其生活史上一定阶段生活在活体植物组织内,但对植物组织没有引起明显病害症状的真菌。植物内生真菌种类丰富,代谢产物活性多样,是天然活性物质的重要来源[7-8],已成为近年来的研究热点[9]。

本研究室筛选到有效杀螺植物醉鱼草和水菖蒲(另文报道),目前,还没有关于醉鱼草、水菖蒲长期相互作用及共同进化的内生真菌及其代谢产物活性研究。本研究以从醉鱼草叶和水菖蒲叶中分别分离得到的 99、103株内生真菌为供试菌株,进行杀螺活性筛选,为开发新型微生物灭螺剂研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

TDL-5-A飞鸽离心机,上海安亭科学仪器制造厂;SPX-250B生化培养箱,上海跃进集团;QYC-211摇床,上海福玛试验设备有限公司;氯硝柳胺,江苏省血吸虫病防治研究所提供。

1.2 供试材料

植物材料:醉鱼草 B uddleia lindleyana,2008年10月采自安徽中医学院药用植物园,经安徽中医学院药学院彭华胜副教授鉴定。水菖蒲 Acorus gram ineus,2008年 10月采自江苏省镇江市,经江苏大学药学院陈钧教授鉴定。

供试钉螺:钉螺采自江苏省镇江市长江边,系湖北钉螺指名亚种 Oncom elania hupensis,由镇江市疾病控制中心韩方岸主任医师鉴定。钉螺于实验室内适应性饲养 1 d,挑选活力强的钉螺供室内杀螺试验。

供试河虾:河虾采自江苏省镇江市长江边,学名日本沼虾M acrobranchium nipponense,由江苏大学韩邦兴博士鉴定。

培养基:PDA培养基 (马铃薯葡萄糖培养基),临用时每毫升培养基中加 80单位的青霉素以抑制细菌生长。

1.3 内生真菌分离

自来水洗净醉鱼草叶、水菖蒲叶及茎,分别剪成小段(片),于超净工作台上进行表面灭菌。灭菌后的材料植入 PDA平板,置 (28±1)℃培养箱中倒置培养。待茎、叶切面处长出菌丝后,挑取其尖端部分接至新的 PDA平板上,28℃培养,经反复纯化后,得醉鱼草和水菖蒲内生真菌纯培养物。菌株编号后转入 PDA斜面,于 4℃冰箱保藏备用。

1.4 内生真菌发酵

从斜面挑取纯化菌种接种于 PDA平板上,待生长旺盛后,用接种针挑取菌落,接种于装有 PDA液体培养基的摇瓶中。每摇瓶 (1000 mL)装入 200 mL。培养基均需 0.1 MPa、121℃、保温 30 min灭菌。摇瓶静置 24 h后,置于恒温摇床上培养。培养温度 28℃,转速为 120 r/min,培养时间为 7 d。将内生真菌发酵产物用 4层无菌纱布过滤,滤液 3 000 r/min离心 15 min,弃去沉淀,取上清液,备用。

1.5 杀螺试验

取发酵液50 mL,用去氯离子水定容至100 mL,即配制成 50%发酵液。浸泡 10只钉螺,另设 1 mg/ L氯硝柳胺水溶液和去氯离子水对照。于 48 h后,弃去药液,用去氯离子水冲洗钉螺 3次,复苏 48 h,水测法和压碎法统计钉螺的死亡数量。水测法是将待测钉螺浸泡于去离子清水中,置于室温下 48 h,凡能爬壁或吸附于壁的皆为活螺。未吸附于壁的,继用压碎法检测。用上述 50%的发酵液筛选出杀螺率为 100%的菌株,再按上述方法配制成试验所需要的浓度进行杀螺活性复筛。各组试验重复 3次。所有去氯离子水组死亡率为 0%,氯硝柳胺组死亡率为100%。

1.6 河虾急性毒性试验

取发酵液配制成 2、4、6、8、10%发酵液。每1000 mL稀释后的发酵液放养 10只河虾,另设去氯离子水对照。试验过程中及时捞去死虾。分别于24、48、72 h统计死亡河虾数。各组试验重复 3次。所有去氯离子水组死亡率为0%。

1.7 数据处理

以钉螺和河虾死亡率为参考序列,应用 SPSS 13.0软件进行分析,对数据进行均值化和差异性处理,比较各菌株发酵液杀灭钉螺效果和对河虾的急性毒性。

2 结论与讨论

2.1 醉鱼草内生真菌杀螺活性菌株筛选

从醉鱼草叶中分离出 99株内生真菌。采用WHO推荐的杀螺剂浸泡试验法对醉鱼草内生真菌的杀螺活性进行初步筛选。50%发酵液 48 h杀螺结果表明,55株菌株发酵液杀螺率在 80%以上,占分离的内生真菌总数 55.6%。其中LL3026等 7株菌株发酵液杀螺率为 100%。25%发酵液 48 h杀螺结果显示,仅 L50198、LL3026发酵液杀螺率为100%。经 12.5%发酵液 48 h杀螺试验,LL3026菌株发酵液杀螺率仍为 100%。见图 1。

图 1 醉鱼草内生真菌发酵液的杀螺活性Fig.1 Molluscicidal activity againstOncomelania hupensisof endophyte fungus fromAcorus gram ineus

2.2 水菖蒲内生真菌杀螺活性菌株筛选

从水菖蒲中分离出 103株内生真菌。采用WHO推荐的杀螺剂浸泡试验法对水菖蒲内生真菌的杀螺活性进行初步筛选。50%发酵液 48 h杀螺结果表明,39株菌株发酵液杀螺率在 80%以上,占分离的内生真菌总数 37.9%。其中 S21等 12株菌株发酵液杀螺率为 100%。25%发酵液 48 h杀螺结果显示,仅 S21、S38菌株发酵液杀螺率为 100%。经 12.5%发酵液 48 h杀螺试验,S21、S38菌株发酵液杀螺率仍为100%。见图2。

图 2 水菖蒲内生真菌发酵液的杀螺活性Fig.2 Molluscicidal activity againstOncom elania hupensisof endophyte fungus fromBuddleia lindleyan

2.3 三株杀螺活性菌株活性研究

为进一步研究 LL3026、S38、S21对钉螺的杀灭效果,设置2%～10%浓度梯度的发酵液进行杀螺试验。试验结果表明,三株内生真菌不同浓度梯度的发酵液均具有较好的杀螺效果,并都有很强的剂量和时间依赖关系。LL3026不同浓度发酵液 24 h杀螺效果不太理想,杀螺率仅达 23.3%～43.3%;而 2%发酵液 48 h杀螺率可达 83.3%,4%发酵液杀螺率即达 100%。所有浓度发酵液72 h杀螺率都达 100%。S38不同浓度发酵液 24 h杀螺率高于LL3026,达 30%～80%;但 48 h和 72 h杀螺率稍低于LL3026,2%发酵液 48 h杀螺率为 65%,6%发酵液 48 h杀螺率为 100%。而 2%发酵液 72 h杀螺率为 95%,其余浓度杀螺率都达 100%。三株内生真菌中,S21杀螺效果相对最弱,各浓度 24 h杀螺率为10%～50%,48 h杀螺率为 30%～90%;10%发酵液 72 h杀螺率达 100%。见图 3。

图 3 LL3026,S38和 S21菌株不同浓度发酵液杀螺活性Fig.3 Molluscicidal activity againstOncom elania hupensis ofLL3026,S38 and S21 broth at the different concertration

2.4 三株杀螺活性菌株的河虾急性毒性

为考察LL3026、S21、S38三株内生真菌对非靶水生生物的毒性,本试验选择河虾为受试对象,以死亡率为指标进行急性毒性试验。实验结果表明,S21各浓度发酵液对河虾几无致死作用,10%发酵液 72 h死亡率仅 20%。LL3026对河虾的致死作用相对较小,各浓度发酵液 24 h死亡率最高为 25%,当发酵液浓度超过 6%时,48 h和 72 h河虾死亡率明显上升,分别达 35%～90%,50%～95%。S38菌株发酵液在三者中对河虾毒性最大,10%发酵液对河虾24 h死亡率即达 80%,随时间和浓度增加,S38菌株发酵液对河虾急性毒性也逐渐增加,10%发酵液 72 h死亡为 100%。见图 4。

图 4 LL3026,S38和 S21菌株不同浓度发酵液的河虾急性毒性Fig.4 M acrobranchium nipponense toxicity assay of LL3026,S38 and S21 broth at the different concertration

2.5 讨论

实验结果表明,醉鱼草和水菖蒲中内生真菌种类丰富,且广泛分布着杀螺活性菌株,分别占分离菌株总数的 55.6%和 37.9%;其中 LL3026、S21、S38发酵液具有很强的杀螺活性,4%的 LL3026发酵液48 h杀螺率 100%,6%的 S38发酵液 48 h杀螺率100%,10%的 S21发酵液 72 h杀螺率 100%。三株菌株的杀螺活性均高于本实验室曾筛选到金钱松内生真菌 JJ18(10%发酵液 72 h杀螺率为 86.7%)[8]。并且在一定浓度下,发酵液对钉螺的毒性远大于对河虾的毒性。

从安全、有效的角度考虑,植物内生真菌杀螺研究有广阔的前景。至今,对内生真菌的杀螺研究还处于一个初始阶段,相对于数量庞大的内生真菌种类而言,才刚刚开始[8]。将植物内生真菌的研究与杀螺研究相结合,应用生物组合化学的方法进行活性成分筛选,发现安全、有效的杀螺先导化合物,应用生物技术改良内生真菌,提高活性成分的含量和产量,对推动生物杀螺剂的筛选和可持续利用具有重要意义。

醉鱼草和水菖蒲中内生真菌可能产生了杀螺活性物质,可以针对性地进行活性跟踪研究[10],分离筛选有效的活性物质,并采用生物技术手段提高活性成分含量和产量,使之成为新型杀螺剂的重要来源。

致谢:感谢安徽中医学院王德群教授、彭华胜副教授、江苏省血吸虫病防治研究所梁幼生研究员和江苏省镇江市疾病预防控制中心韩方岸主任医师给予的支持!

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Screen ing ofM olluscicidal Activity aga instOncom elania hupensisof Endophyte Fungus

HAN Bang-xing1,2,CHEN Jun1＊,ZHOU Xiao-kun1,FANGWei-wei1,L IU Yi-dan1,HAO Lei1,N IU Cheng-cheng11School of Phar m acy,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2Research Center of Plant Cell Engineering of Anhui Province,Lu’an 237012,China

Molluscicidal testswere performed according to the immersion test suggested byWHO to screen molluscicidal activity endophyte funguswhichwere isolated from Buddleia lindleyana andAcorus gramineus.TheMacrobranchium nipponense toxicity assaywas used to appraise toxicity to non target aquatic species.The result indicated that the LL3026, S38 and S21 broth had significant activity against Oncomelania hupensis.The mortality rates of snails immersed by LL3026,S38 and S21 broth were 100.0%at the concertration of 10%,respectively.The endophyte fungus had no acute toxicity toMacrobranchium nipponense.

Buddleia lindleyana;Acorus gram ineus;Endophyte;Oncom elania hupensis;Molluscicidal effect

1001-6880(2010)02-0315-04

2009-08-24 接受日期:2009-11-24

＊通讯作者 Tel:0511-88780196,Email:syxchenjun@126.com

R383.24

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