文冠果油中植物甾醇的提取及其抑菌特性研究

曹立强,李丹丹,邓 红,韩 瑞,田子卿

陕西师范大学食品工程与营养科学学院,西安 710062

文冠果油中植物甾醇的提取及其抑菌特性研究

曹立强,李丹丹,邓 红＊,韩 瑞,田子卿

陕西师范大学食品工程与营养科学学院,西安 710062

以文冠果油为原料,采用皂化法提取文冠果植物甾醇。通过均匀试验设计研究了碱液用量、提取温度、提取时间等因素对文冠果油中植物甾醇纯度和提取率影响,初步确定了皂化法提取工艺条件,并采用抑菌圈法分析了甾醇粗提物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毛霉和青霉的抑菌特性。结果表明,文冠果植物甾醇提取的较佳工艺参数为:浓度 1 moL/L的氢氧化钠碱液与油用量比为 14︰ 1(mL/g),提取温度 75℃,提取时间 40 min。文冠果甾醇粗提物对毛霉和青霉无抑制作用,对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有明显抑制作用,且对大肠杆菌的抑制作用尤为突出,文冠果植物甾醇是一种较好的抗菌剂。

文冠果油;植物甾醇;提取;抑菌特性

文冠果 (Xanthoceras sorbifoliaBunge)是无患子科文冠果属落叶乔木或大灌木,原产我国北方干旱寒冷地区,早在 1200年前,我国就有利用文冠果资源的记载[1]。文冠果是我国北方地区很有发展前途的珍稀木本油料和水土保持树种[2],其种子可食用也可榨油,种仁含油 55%～65%,含蛋白质 23%～26%,总碳水化合物8%～9%,总糖2%～3%,文冠果皂甙 0.5%,18种微量元素等,据朱丹、黄玉广等人的研究表明,文冠果种仁具有很高的营养价值[3]。此外,文冠果种仁油中非皂化部分含有较多的甾醇,具有很高的医用价值[4]。

植物甾醇是一种类似于环状醇结构的物质,主要存在于植物油不皂化物中。不同植物油中所含的植物甾醇不一样,天然植物甾醇主要有 4种,即谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和菜籽甾醇[5]。植物甾醇对人体的诸多功能及其特有的性质,使植物甾醇及其衍生物在医药、食品、化妆品及饲料、畜牧等行业中得到了广泛的应用,并展现出其独特效果和良好开拓前景。作为油脂中一种功能性成分,植物甾醇也是油脂工程研究的重要内容之一[6]。

目前有关从文冠果油中提取植物甾醇的工艺的研究尚未报道,且关于植物甾醇的抗菌特性的研究也较少。本项目以冷榨文冠果油后的废弃油饼为原料制备文冠果油,采用皂化法[7]提取文冠果植物甾醇,以期为文冠果油脂的深度开发及植物甾醇新资源的开辟提供试验依据。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

文冠果籽购自陕西省志丹县特种作物研究所,破壳取仁,以冷榨法制取文冠果种仁油之后的废弃油饼为原料,粉碎过 40目筛,备用。

1.1.2 试剂

石油醚 (60～90℃),95%乙醇,氢氧化钠,无水硫酸钠,乙酸酐,丙酮,酚酞,氢氧化钾等均为分析纯试剂。

1.1.3 试验菌株

大肠杆菌 (coli)、枯草芽孢杆菌 (B acillussubtilis)、毛霉 (Hairm ould)、青霉 (Penicillium)均由本校生命科学学院微生物实验室提供。

1.1.4 主要仪器

KQ-200KDE型高功率数控超声仪:昆山市超声仪器有限公司;BS224S电子分析天平:北京赛多利斯仪器系统有限公司;DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器:巩义市英峪予华仪器厂;PHS-3C精密 pH计:上海精密科学仪器有限公司;可见光分光光度仪:尤尼柯(上海)仪器有限公司;高压灭菌锅、恒温培养箱等。

1.2 试验方法

1.2.1 文冠果油的制备

取一定量的冷榨文冠果废弃油饼粉置于 500 mL平底烧瓶中,采用超声辅助溶剂提取法制备文冠果油。以沸程 60～90℃的石油醚为溶剂,文冠果油的提取工艺参数[8]为:料液比 1∶10(g/mL)、提取温度60℃、提取时间 35 min、超声波频率60 kHz,在该工艺条件下浸提四次,得到文冠果油。

1.2.2 文冠果油中植物甾醇的提取

皂化法工艺流程:文冠果油→加碱皂化→萃取温→浓缩→甾醇粗制品。皂化操作方法:准确称取文冠果油 15 g置于圆底烧瓶中,按一定比例加入 1 mol/L碱-乙醇溶液,在搅拌下缓慢升温至一定温度,恒温磁力搅拌器中加热回流 2 h,使油完全皂化且油珠消失,即得皂化液。回收乙醇 20 mL,皂化液加蒸馏水 125 mL冷却,备用。取皂化液 300 mL,用300 mL乙醚提取 3次,合并乙醚提取液。提取液用80 mL蒸馏水水洗 3次,再依次用 80 mL 0.5 mol/L氢氧化钾溶液和 80 mL蒸馏水连续洗涤醚液 2次,然后再水洗至加入酚酞指示剂后洗涤液呈无色为止。最后将提取液用无水硫酸钠干燥,常温下减压蒸馏回收乙醚后,得到文冠果油粗甾醇。计算公式:

1.2.3 甾醇抑菌特性

供试菌种为细菌:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌;霉菌:毛霉、青霉。

(1)植物甾醇的稀释:取 0.1 g植物甾醇粗提物注入小试管中,用移液管移取一定量丙酮配制成0.8 g/mL的溶液,以二倍稀释法再用丙酮配置成 1/ 2倍、1/4倍、1/6倍的溶液备用。

(2)培养基的制备及其灭菌:按照相关方法制备牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯培养基,倒平板。平板、移液管和所用的滤纸片等相应器皿在 165℃高温下灭菌 2 h,蒸馏水、培养基在 121℃的高压蒸汽锅中灭菌 20 min。

(3)抑菌试验:将各菌种于试验前 16 h活化,从活化的菌种中各取 0.2 mL放入已灭菌的平板中涂布。采用抑菌圈法检测抑菌效果,以蒸馏水和丙酮作对照,抑菌圈的大小表示了抑菌特性的强弱。

抑菌特性计算方法:

式中:-Φ为三次直径的平均值;Φ1为对照生长直径;Φ2为各试验处理生长直径;6为滤纸片直径。

1.3 分析方法

1.3.1 植物甾醇的定性测定

采用金世梅、朱惠等[9]的方法对植物甾醇进行定性分析。

1.3.2 植物甾醇的纯度分析

采用改进的 Lebennann-Burchard比色法测定甾醇样品中总甾醇的含量。

1.4 文冠果油甾醇提取试验设计

本试验采用了 U10(53)均匀试验设计[10]。以粗提物纯度为试验指标,试验因素分别为碱液用量、温度、时间,均匀试验设计如表 1所示。

表 1 U10(53)均匀试验设计表Table 1 Uniform design table

2(10:1) 3(65) 40 4 2(10:1) 4(70) 50 5 3(12:1) 5(75) 60 6 3(12:1) 1(55) 20 7 4(14:1) 2(60) 30 8 4(14:1) 3(65) 40 9 5(16:1) 4(70) 50 10 5(16:1) 5(75) 60 3

2 结果与分析

2.1 植物甾醇定量分析标准曲线

按照 1.3.2的方法测得甾醇浓度与吸光度的对应值,绘制植物甾醇定量分析标准曲线 (如图 1所示)。得到曲线的回归方程为:y=5.37x-0.0279,相关系数 R2=0.986,说明曲线回归性较好,可进行定量分析。此方法简单快速,整个操作仅需 0.5 h,适用于工厂的快速测定,实用性强。

2.2 文冠果油皂化粗提物的定性分析

将粗提物溶于氯仿,在试管中,沿管壁缓缓加浓硫酸,则成为两液层,接界面显现为玫瑰红色;再将粗提物溶于乙酸酐,滴加浓硫酸,溶液呈黄绿色。定性分析结果表明所提取的物质中确含有植物甾醇。

图 1 植物甾醇浓度标准曲线Fig.1 Concentration of standard curve for phytosterol

2.3 文冠果油中植物甾醇的提取试验

分别以碱液用量、提取温度、碱的种类为试验因素,以甾醇提取率、粗提物纯度为试验指标,采用U10(53)均匀试验设计表进行试验,结果如表 2所示,将实验结果经DPS软件数据处理系统进行二次多项式逐步回归分析,结果如表 3所示。

表 2 U10(53)均匀设计试验结果Table 2 Unifor m design experimental results

利用DPS软件,根据表 2的数据得出甾醇纯度与试验因素的二次回归方程为:Y1=5.49933333+ 6.770743590X1-8.080410256X2+3.1080000000X3-0.6221794872+1.3705128205,相关系数 Ra= 0.6817,回归方程显著性检验 p=0.1914>0.1,说明各因素水平对甾醇的提取纯度的影响不显著。

同样得出甾醇的提取率与试验因素的二次回归方程为:

Y2=-1.429528302+2.1452566038X2-0.07165534591-0.3198817610+0.24666666667,回归方程显著性检验 p=0.0359<0.05,说明各因素水平对甾醇的提取纯度的影响显著。相关系数 Ra=0.8347,所得回归方程能较好预测皂化法的提取率。

其次,从表 2的结果可知,纯度最高时各因素组合与甾醇提取率最高时各个因素组合并不完全相同,综合考虑纯度和提取率,确定试验较佳条件为:碱液用量 14∶1,提取温度 75℃,皂化时间 40 min。

表 3 最优条件验证试验结果Table 3 Optimal conditions verify experimental results

在较优条件下,实际值得到的文冠果油甾醇纯度和提取率均与预测值基本吻合,说明上述试验条件为文冠果植物甾醇最优提取条件,即碱液用量 14∶1(mL/g),提取温度 75℃,皂化时间 40 min。此条件下,甾醇的提取率约为 3%,即每吨的废油饼可以生产30千克的粗甾醇,若按照甾醇在国际市场上的价格来算,其经济效益以及社会效益比较可观。

2.4 文冠果油中植物甾醇的抑菌特性

按照 2.2.3的方法进行试验,文冠果植物甾醇粗提物的抑菌特性试验结果如表 4所示。

表 4 文冠果油中植物甾醇的抑菌特性试验结果Table 4 The phytosterol ofShinyleaf yellowhornseed oil phytocholesterol characteristic experimental results

抑菌圈的直径大小显示了文冠果植物甾醇粗提物的抑菌效果。由表 4可知,文冠果植物甾醇粗提物对细菌有抗菌特性,对大肠杆菌的抑菌效果要比对枯草芽孢杆菌的抑菌效果好;而文冠果植物甾醇对毛霉和青霉没有抑菌作用。

此外,文冠果植物甾醇对大肠杆菌的最低抑菌浓度(M IC)为 0.06(mg/mL),在试验范围内最大抑制率为 55.88%。抑制枯草芽孢杆菌的文冠果植物甾醇最小浓度为 0.02(mg/mL),在试验范围内最大抑制率为 44.95%,与常用防腐剂苯甲酸钠比较,相同浓度下,后者抑菌效果不如植物甾醇好,并且通过对比,其M IC比植物甾醇M IC普遍偏高。

由于本试验样品仅为粗提物,未对文冠果植物甾醇提取物进行分离纯化,另外,试验所选菌种种类较少,无法说明对其他类型菌种有无抑菌效果,需要进一步对甾醇粗提物进行纯化,扩大菌种范围,深入探讨其抑菌效果,为食品工业开发新型天然抗菌剂提供试验依据。

3 结论

(1)文冠果植物甾醇的较佳提取工艺为:所用碱为 1 mol/L的氢氧化钠,皂化时间 40 min,碱液与油用量比为 14∶1(mL/g),提取温度 75℃。

(2)文冠果甾醇粗提物对毛霉和青霉无抑制作用,对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌有明显抑制作用,对大肠杆菌的抑制作用尤为突出,文冠果植物甾醇是一种较好的抗菌剂。

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2 Gao QM(高启明),Hou JT(侯江涛),L I Y(李阳).Cultivated application and developmental prospect ofXanthoceras sorbifoliaBunge.Quarterly of ForestBy-product and Speciality In China(中国林副特产),2005,75,4:56-57.

3 Zhu D(朱丹),HuQ(胡群),LiXB(李霞冰).The research of the shinyleaf yellowhorn's chemical composition prerun and comprehensive utilization.Territory Nat Res Stuty(国土与自然资源研究),1997,1:69-71.

4 Li ZL(李占林).Studies on the chemical constituents of the husks of shinyleaf yellowhorn.J Shenyang Phar m Univ(沈阳药科大学学报),2005,7:271-272.

5 YanMH(严梅和),Li PW(李佩文).The separation identification and determination of the unsaponifiable matters in shinyleaf yellowhorn oils.Sci Silvae Sinic(林业科学),1984, 20:389-396.

6 Itoth T,Tamura,T.Matsumoto.Sterol composition of 19 vegetable oils.J Am erican O il Chem Society,1973,50:122-125.

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8 Deng H(邓红),Qiu NX(仇农学),Sun J(孙俊),et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction technology of oil fromXanthoceras sorborifoliaburge seeds.Transactions of the Chinese Society of Agric Eng(农业工程学报),2007,23: 249-253.

9 Jin S M(金世梅),Zhu H(朱惠),Huang J(黄静),et al.I-dentification of phytoserin and study on its quantification test.China food additives(中国食品添加剂),2006,3:146-150.

10 Liu KY(刘魁英).Food Research and Data Analysis(食品研究与数据分析).Beijing:China Light Industrial Press, 2005,213-229.

Study on the Extraction and Antibacterial Properties of Phytosterol from the Shinyleaf Yellowhorn Seed O il

CAO Li-qiang,L IDan-dan,DENG Hong,HAN Rui,T IAN Zi-qing
College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Nor m alUniversity,Xi’an 710062,China

Using shinyleaf yellowhorn seed oil as raw materials,the phytosterol was extracted with saponification method.The influence factors such as dosage of alkali,extracting temperature and time to the pureness and extracting ratio of phytosterolwas discussed through the uniform exper imental design,and the purenessof phytosterolwas analyzed through visible light spectrophotometry.At the same time,the antibacterialpropertiesofphytosterol to the E.coli,Bacillus subtilis,Mucor and Penicillium was determined using antibacterial ring method.The results show that the optimal technical parameters are:dosage of alkali liquor(1 moL/L)14 mL/g oil,extracting temperature 75℃,extracting time is40 min. The crude extraction of phytosterol have stronger antibacterial effect on the Escherichia coli and Bacillus subtilis,no effect on theMucor and Penicillium.The shinyleaf yellowhorn phytosterol are better antibacterial agent.

shinyleaf yellowhorn seed oil;phytosterol;extraction;antibacterial properties

1001-6880(2010)02-0334-05

2009-07-06 接受日期:2009-11-27

陕西师范大学优秀科技预研项目(200802020)

＊通讯作者 Tel:029-85310410;E-mail:deng67hongli@sina.com

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