金标层析法检测猪瘟病毒抗原的临床应用

权中会,阴明亮,魏拣选,张国士,马保华

(1.西北农林科技大学动物医学院西安宠物医院,陕西西安710065;2.西北农林科技大学动物医院,陕西杨凌712100)

猪瘟(CSF)是严重危害养猪业的重要传染病之一,在临床上猪瘟常表现典型和非典型发病特征,因此及时准确的实验室诊断尤为重要。免疫胶体金层析诊断法近年来在生物医学各领域得到广泛应用,在动物医学临床诊断方面的应用起步较晚,最近几年才见到相应报道。该技术的基本原理是将配体(抗体或抗原)以线状包被于硝酸纤维素膜等微孔薄膜上,并用胶体金标记另一配体或其他物质以干态固定在吸水材料上。当加入待检样品时,通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动,当泳动至胶体金标记处时,如样品中含有待检受体,则发生第一步特异性免疫反应。第一步特异性免疫反应形成的免疫复合物继续泳动至线状包被区时,发生第二步特异性免疫反应,所形成的免疫复合物被截留在包被的线状区,通过标记的胶体金而显紫红色条带(检测带),而游离标记物则越过检测带,与结合标记物自动分离[1]。该诊断技术操作简单、特异性强,用时较短(可在15～25min获得直观判断结果),特别适合于广大基层兽医人员以及大批量检测和大面积普查等[2]。2008年1～7月,我们应用猪瘟病毒抗原快速金标检测卡对西北农林科技大学动物医院收治的临床疑似猪瘟或无名高热的134头病猪进行了猪瘟病毒抗原检测。

1 材料

1.1 猪瘟病毒抗原快速金标检测卡 深圳市康百得生物科技有限公司出品,批号20071020。

1.2 待检样品 临床疑似猪瘟病猪或无名高热病猪的血液样本共134头份,其中哺乳仔猪23头份,断奶猪89头份,母猪22头份;样品均为来本院就诊的近15d内未接种过猪瘟疫苗的病猪,主要来自当地农村散养户和小养猪场。从病猪耳静脉、前腔静脉或从病死猪心脏采血,分离血清,或者用EDTAK2抗凝,离心分离血浆。根据病猪临床症状和病理变化的不同,将样本分为两类：(1)临床症状和病理变化较典型的疑似猪瘟病例,其样本55头份。急性型病猪体温41℃～42℃,高热稽留;白细胞数降低至10×109以下;眼结膜潮红,两眼有多量黏液、脓性分泌物;皮肤有出血点或斑;初便秘后腹泻,粪便恶臭;常并发肺炎和纤维素性坏死性肠炎。慢性型病猪的体温稽留在 40℃左右;精神委顿,消瘦,贫血,衰弱,病情时轻时重,食欲时好时坏,粪便时干时稀;病程较长者,皮肤出现淤血斑和坏死块,以腹下部为多见,有时也出现紫耳朵、干尾巴、紫斑蹄。病理变化：急性型呈现以多发性出血为特征的败血症变化,皮肤、黏膜、浆膜广泛出血,血液凝固不良,消化道、呼吸道和泌尿生殖道有卡他性、纤维素性和出血性炎症反应。淋巴结水肿、出血,呈暗红色,切面呈大理石样色彩;肾脏有针尖状出血点或大的出血斑,呈现所谓的“雀斑肾”外观;脾脏边缘梗死;膀胱、喉头黏膜及会厌软骨上有程度不同的出血点;大肠的回盲瓣附近淋巴滤泡肿大隆起、有出血和坏死;病程稍久的病例,可见纤维素性肺炎或坏死性化脓性肺炎,肺胸膜粗糙。慢性型的出血病变轻微,但在回盲口附近及结肠常有特征性的伪膜性坏死和溃疡,呈纽扣状;断奶仔猪的肋骨末端与软骨交界处发生钙化,可见有黄色骨化线。(2)临床症状和病理变化不典型或无名高热病猪,其样本79头份。病猪临床症状较轻,体温一般在40℃～41℃左右;有的病猪耳、尾、四肢末端皮肤坏死,发育停滞,到后期站立不稳、后肢瘫痪,部分跗关节肿大。病理变化不典型,淋巴结水肿,轻度出血或不出血;肾出血点不一致;脾稍肿,有1～2处梗死灶;回盲瓣很少出现纽扣状溃疡,但有溃疡和坏死病理变化。

2 方法

将检测卡水平放置,做好标记,在检测卡的加样孔内加入2滴(70～100μL)待检血清/血浆样品,室温下静置,20min内判定结果。阳性：在观察孔内,检测线区(T)及对照线区(C)同时出现紫红色线。阴性：在观察孔内,只有对照线区出现一条紫红色线。失效：在观察孔内,对照线区(C)和检测线区(T)都不出现紫红色线;或仅检测线区(T)出现紫红色线。

3 结果

应用猪瘟抗原金标检测卡共检测病猪样本134头份,总阳性率为67.16%(90/134);其中哺乳仔猪阳性率21.74%(5/23);断奶猪阳性率77.53%(69/89);母猪阳性率72.72%(16/22)。检测临床症状和病理变化较典型的疑似猪瘟病例样本55头份,阳性符合率为89.10%(49/55);检测临床症状和病理变化不典型或无名高热病猪样本79头份,阳性检出率为51.90%(41/79),检测结果见表1。

表1 猪瘟病毒抗原金标检测卡检测结果

4 小结及讨论

检测结果显示,哺乳仔猪的猪瘟病毒阳性率最低,这可能与哺乳仔猪受母源抗体的保护以及与外界环境接触时间相对较短有关。断奶猪的猪瘟病毒阳性率最高,可能是由于断奶后的猪失去母源抗体的保护,有些猪尚未及时接种猪瘟疫苗,或已接种疫苗,但因各种原因猪体免疫力不强,加之此时正值仔猪出售、贩运高峰,从而增加了猪感染猪瘟病毒的可能。母猪的猪瘟病毒抗原阳性率也比较高,可能是由于近来仔猪市场价格上涨,这些猪多是农村散养户新留的母猪,疫苗注射率较低;或者是经产母猪,但近年未加强免疫;而且病猪多是在发病后经多方治疗未有明显效果的情况下来我院就诊的,感染猪瘟病毒的可能性增大。近年来,猪的高热病发病率较高,据报道有高致病性蓝耳病、附红细胞体病、猪瘟、无名高热等[3]。此外,猪链球菌病、弓形体病、圆环病毒感染、猪肺疫、传染性胸膜肺炎、副猪嗜血杆菌病等也时有发生。这些疾病的某些症状和部分病变与猪瘟有相似之处,临床上容易造成误诊。检测结果显示,猪瘟仍然是当地猪的重要疾病之一,所以必须十分重视猪瘟的防制。

我们应用猪瘟病毒抗原金标卡检测临床症状和病理变化较典型的疑似猪瘟病例,二者阳性符合率为89.09%,结果证实该金标检测卡在猪瘟的快速诊断中具有一定的应用价值。应用猪瘟病毒抗原金标检测卡,极大的方便了猪瘟的诊断,取得了明显的效果。

[1]许保疆,郭成留.免疫层析快速诊断试纸条的制备及在动物疫病诊断上的应用[J].中国畜牧兽医,2009,36(3)：48-51.

[2]陈龙宾,王爱华,苏小庚,等.猪瘟病毒胶体金免疫层析检测方法的建立及应用[J].中国兽医科学,2007,37(6)：496-499.

[3]邓衔柏,廖明,李玉谷,等.我国南方部分猪场发生高热病的疫情调查初报[J].中国兽医杂志,2007,43(9)：40-41.