鸡源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的临床分离及多重PCR鉴定

娜仁高娃,陈 霞,吴聪明

(中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

弯曲菌(Campylobacter)尤其是空肠弯曲菌(C.jejuni)是重要的人畜共患病病原菌,在人可引起急性胃肠炎,感染严重者伴有心内膜炎、肺炎、败血症、血栓静脉炎、脑膜炎、多发性关节炎以及格林-巴利综合征等疾病[1-3]。家禽、家畜、宠物等动物是弯曲菌的常见宿主,因此研究动物源弯曲菌具有重要的公共卫生意义。由于弯曲菌体外培养条件苛刻,需要专门的培养设备,而且生长周期较长,鉴定复杂,普通实验室难以开展相关工作。本文在研究动物源弯曲菌过程中摸索出一套鸡源空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离培养及多重PCR鉴定方法,该方法操作简便、快速,易于掌握,适用于基层实验室分离鉴定弯曲菌。

1 材料与方法

1.1 质控菌株 空肠弯曲菌标准菌株ATCC 33560,金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC29213,均购于美国菌种保藏中心;大肠杆菌标准菌株ATCC25922,购于中国药品生物制品检定所,鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌由本实验室保存。

1.2 试剂及培养基 Skirrow氏弯曲菌选择性培养基基础及 Campy lobacter supplementⅢ(Skirrow),购自Sigma公司;布氏肉汤、哥伦比亚血琼脂基础及无菌脱纤绵羊血,购自北京陆桥技术有限责任公司;2X Taq PCR M asterM ix、低分子量 PCR M arker,购自天根生化科技(北京)有限公司;弯曲菌API鉴定条,购自Biomerieux公司。其他常规试剂均为国产分析纯试剂。

1.3 样本采集及菌株分离 用10 mL灭菌试管采集新鲜鸡粪或盲肠内容物样本3～5 g,低温包装运送至实验室,用接菌环沾取少量(约0.1 g)划线接种到Skirrow弯曲菌选择性培养基上。将接种好的培养基置于二氧化碳培养箱内,微需氧条件下(5%O2、10%CO2、85%N2),42℃培养 48～ 72 h。选取不溶血半透明圆形菌落接种于哥伦比亚血琼脂培养基进行纯培养。

1.4 菌株API鉴定 选取氧化酶结果阳性的菌株,用生理盐水洗下哥伦比亚血琼脂培养基上的纯培养物制成6个麦氏浊度的菌悬液,按弯曲菌API鉴定条(API 20 800)使用说明书接种并培养,判读培养结果,查阅API 20 800鉴定标准进行菌株鉴定。

1.5 PCR引物设计 根据GenBank登录的序列和Georgios Keramas[4-5]等报道的序列合成 3对PCR引物：针对弯曲菌属16S rRNA基因的引物(16S-F和16S-R);针对空肠弯曲菌hipO基因的引物(HIP-F和 H IP-R);针对结肠弯曲菌 16S-23S rRNA基因的引物(CC-F和CC-R)。各对引物核苷酸序列及预期扩增片段长度见表1。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

表1 用于鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的3对PCR引物序列、预期扩增片段长度

1.6 PCR鉴定 挑取哥伦比亚血琼脂培养基上的纯培养物置于盛有800μL pH8.0 Tris-EDTA的离心管中,12 000 r/m in常温离心1 m in,去上清。重复一次上述离心步骤后,用80μL Tris-EDTA重悬沉淀,放入100℃沸水中煮沸10 m in。取出置于冰浴中冷却5m in后,12 000 r/m in(4℃)离心3 m in,取上清液作为PCR模板。PCR反应体系为20μL,其中2X Taq PCR M asterM ix 10μL,DNA模板1 μL,上下游引物(10 nmol/L)各0.5μL,灭菌超纯水补足至20μL。PCR循环参数：94℃预变性10m in,94℃变性1 min,56℃退火40 s,72℃延伸 1 min,30个循环后 72℃再延伸 7 min。PCR产物以 DL-2 000作为DNA M arker,以1.2%琼脂糖凝胶(含有0.5mg/L Goldview染料)、120 V电泳25m in,A lpha凝胶成像系统成像。PCR过程中以空肠弯曲菌ATCC33560作为阳性质控,以大肠杆菌ATCC25922作为阴性质控。

2 结果与分析

2.1 菌落形态 鸡源的弯曲菌主要为空肠弯曲菌和结肠弯曲菌,两者均为嗜热微需氧菌,体外最适培养条件为 42℃,5%O2、10%CO2、85%N2。上述两种弯曲菌在血琼脂培养基上不溶血,初代分离的典型菌落形态为圆形,直径 1～2 mm,隆起、中凸、光滑、闪光、边缘整齐、半透明而中心颜色较暗,菌落呈浅灰色或黄褐色。

2.2 特异性试验 采用本文建立的PCR方法,扩增空肠弯曲菌ATCC33560,在314 bp和149 bp处分别获得预期的属特异性条带和种特异性条带;扩增大肠杆菌ATCC25922未出现任何条带(见图1)。上述结果说明所建立的PCR法有较强的特异性。

图1 弯曲菌多重PCR鉴定电泳结果

2.3 方法应用 应用建立的弯曲菌临床分离及多重PCR鉴定方法,我们从774份新鲜鸡粪样品中分离出261株弯曲菌,其中208株空肠弯曲菌,53株结肠弯曲菌,总体分离率为33.7%。

2.4 PCR鉴定方法验证 从PCR鉴定的弯曲菌中随机挑取26株弯曲菌(其中空肠弯曲菌16株;结肠弯曲菌11株)进行API鉴定,鉴定结果与PCR结果一致。表明上述建立的弯曲菌多重PCR鉴定方法完全可在临床菌株分离工作中应用。

3 讨论

3.1 弯曲菌为苛养菌,营养要求高,体外培养需在培养基中加入一定量的全血或血清,通常含量为5%。此外,临床分离弯曲菌时选择性培养必不可少,加入一定量的抗生素增补剂(如多粘菌素B,1 250 IU;万古霉素,5mg;三甲氧苄氨嘧啶,2.5mg)可抑制其他肠道菌的生长,以提高弯曲菌的分离率。

3.2 生化鉴定弯曲菌不仅操作繁琐,而且结果不典型时,常需要传代培养后再鉴定,检测周期一般需要2～3周。法国生物梅里埃生产的API鉴定条一定程度上简化了繁琐的生化鉴定程序,但价格昂贵,使之难以成为一般实验室的常规鉴定方法。本文建立的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌多重PCR鉴定方法,不仅灵敏度高、特异性强,而且操作简便快速、成本低廉,适用于基层实验室开展鸡源弯曲菌分离鉴定及其他相关研究工作。

3.3 H uo-Shu H等[6]应用ceuE基因建立了检测空肠、结肠弯曲菌的多重PCR方法,可分别扩增出了645 bp和783 bp的特异性片段,但部分肠道菌可扩增出小于645 bp的非特异性片段。何蕊等[7]以 mapA基因建立了检测空肠弯曲菌的PCR方法,但mapA基因的特异性不强,而且并非所有的空肠弯曲菌都能够扩增出589 bp的特异性片段。本文建立的多重PCR法不仅能扩增出弯曲菌属的特异性片段,而且能分别扩增出空肠、结肠弯曲菌各自的特异性片段,因此具有较强的特异性。尤其是本方法PCR扩增的马脲酸酶基因(hipO)为空肠弯曲菌(包括空肠亚种和德莱亚种)所特有[8],因此能有效区分空肠弯曲菌和结肠弯曲菌。

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