八面蒙脱石联合莫沙必利灌胃对急性坏死性胰腺炎大鼠回肠NF-κB活化的影响

许娟娟 彭晶晶 胡耿诚 钱伟 丁震 刘俊 侯晓华

·论著·

八面蒙脱石联合莫沙必利灌胃对急性坏死性胰腺炎大鼠回肠NF-κB活化的影响

许娟娟 彭晶晶 胡耿诚 钱伟 丁震 刘俊 侯晓华

目的探讨八面蒙脱石对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠回肠黏膜NF-κB活化的影响。方法120只雄性SD大鼠按完全随机法分为假手术组、ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组和莫沙比利+八面蒙脱石(联合)组，每组24只大鼠。采用胰胆管内逆行注射牛磺胆酸钠诱导大鼠ANP模型；假手术组开腹注射生理盐水后关腹。各治疗组于造模前30 min分别给予相应药物灌胃1次。术后3、6、12 h分批处死动物。取胰腺组织行病理检查；取血测定TNF-α、IL-1水平；取回肠观察超微结构的改变；免疫组化法检测回肠黏膜NF-κB的表达；Western blotting法检测回肠组织IκBα水平。结果与假手术组比较，ANP组胰腺损伤明显，血TNF-α、IL-1水平明显升高[(36.79±1.14)pg/ml对(9.00±0.01)pg/ml，(25.17±1.93)ng/ml对(3.45±0.11)ng/ml,P值均<0.05]，回肠绒毛高度显著下降[(0.25±0.22)×10-6m对(1.50±0.33)×10-6m，P<0.05]，柱状细胞指数显著降低[(2.40±1.65)×106个/m对(13.5±4.28)×106个/m，P<0.05]，NF-kB表达增加(6.92±1.54对1.28±0.29，P<0.05)，IκBα蛋白水平下降(3.30±1.99对24.32±1.93 )。莫沙必利组和八面蒙脱石组的各项指标与ANP组均无显著差异。联合组的血TNF-α、IL-1水平[(30.57±0.39)pg/ml和(13.45±1.26)ng/ml]、回肠绒毛高度和柱状细胞指数[(1.05±0.28)×10-6m和(10.10±2.50)×106个/m]、NF-kB活化(4.32±1.57)和IκBα蛋白水平(15.99±1.26)均与ANP组有统计学差异(P值均<0.05)。结论八面蒙脱石联合莫沙必利灌胃能减少ANP大鼠回肠黏膜NF-κB的大量激活，减轻胰腺和回肠黏膜的损伤程度。

胰腺炎，急性坏死性； NF-κB； IκBα； 回肠； 八面蒙脱石； 莫沙必利

重症急性胰腺炎(SAP)是常见的急腹症之一，其发病机制较为复杂，有多种因子参与并起着非常重要的作用[1]。NF-κB作为重要的基因转录因子，在SAP中高表达并对SAP的发生发展起重要作用[2]。八面蒙脱石可吸附多种病原体，保护肠黏膜屏障，减少因细菌内毒素易位而引起的炎症介质过度释放[3]。因此，本研究应用八面蒙脱石治疗急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠，观察其对肠道损伤的保护作用，为临床应用打下基础。由于ANP时常并发肠蠕动减缓，为确保八面蒙脱石到达肠道，本实验加用促胃肠动力药莫沙必利。

材料和方法

一、动物模型制备及实验分组

120只雄性SD大鼠，体重200～250 g，清洁级，由华中科技大学同济医学院动物中心提供。大鼠按完全随机法分为假手术组、ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组和八面蒙脱石+莫沙必利(联合)组，每组24只。采用逆行胰胆管注射牛磺胆酸钠制备ANP模型[4]。假手术组开腹注射生理盐水后关腹，其他各组于造模前30 min分别应用生理盐水、0.03%莫沙必利、6%八面蒙脱石、莫沙必利+八面蒙脱石灌胃1次，灌胃剂量为0.1 ml/100 g体重。术后3、6、12 h分批处死大鼠。

二、血TNF-α、IL-1检测

采用酶联免疫吸附法，按试剂盒说明书操作。

三、胰腺及回肠组织病理检查

胰腺组织常规行病理学检查，按照许永春等[4]的标准评分。回肠组织送华中科技大学同济医学院电镜中心行超微结构检查。

四、回肠组织NF-κB表达的检测

采用S-P免疫组化法。一抗工作浓度为1∶100。每张切片取5个视野，应用Image-Pro Plus分析软件测定NF-κB蛋白阳性产物的积分光密度值，取均值。

五、回肠组织IκBα表达的检测

取50 mg回肠组织，用PIRA裂解液制备匀浆，蛋白定量后行Western blotting。用惠普扫描仪扫描，quantity one软件计算各条带灰度值，以IκBα/β-actin的灰度值比作为IκBα相对表达量。

六、统计学方法

结 果

一、胰腺组织病理学改变

假手术组胰腺正常。ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组大鼠初期胰腺水肿，以后出现皂化斑及出血坏死灶，有血性腹水；镜下胰腺间质水肿，随时间延长，腺泡小叶结构破坏，出血，凝固性或脂肪坏死，大量中性粒细胞和单核细胞浸润。联合组胰腺损伤明显减轻，胰腺病理评分较ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组显著降低(P<0.05，图1、图2)。

图1 假手术组(a)、ANP组(b)、莫沙必利组(c)、八面蒙脱石组(d)和联合组 (e) 6 h点的胰腺病理改变(HE ×20)

注：与假手术组比较,aP<0.05;与ANP组比较,bP<0.05

二、回肠组织超微结构改变

假手术组回肠绒毛高度为(1.50±0.33)×10-6m；柱状细胞指数(柱状细胞数/肌层黏膜长度)为(13.5±4.28)×106个/m。ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组回肠组织紧密连接条索缩短、数量减少甚至结构模糊，细胞凋亡明显增加(图3)，回肠绒毛高度分别为(0.25±0.22)×10-6m、(0.38±0.27)×10-6m、(0.33±0.26)×10-6m；柱状细胞指数分别为(2.40±1.65)×106个/m、(3.00±1.43)×106个/m、(2.60±2.52)×106个/m。均显著低于假手术组(P值均<0.05)。联合组为(1.05±0.28)×106m和(10.10±2.50)×106个/m，均显著高于上述3组(P<0.05)，而与假手术组无显著差异。

三、各组血TNF-α、IL-1水平的变化

ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组血清TNF-α、IL-1水平较假手术组明显升高(P值均<0.05)，而联合组较上述3组显著降低(P值均<0.05)，但仍显著高于假手术组(表1，P<0.05)。

四、回肠黏膜组织NF-κB表达

假手术组少见NF-κB的阳性表达；ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组见大量NF-κB阳性细胞,主要位于肠绒毛顶端的肠上皮细胞和靠近肠绒毛顶端的单核细胞；联合组活化细胞数减少(图4)。5组NF-κB 活化量分别为1.28±0.29、6.92±1.54、6.28±1.59、6.34±1.43和4.32±1.57。联合组较ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组显著减少(P值均<0.05)，但仍高于假手术组(P<0.05)。

表1 各组大鼠血TNF-α和IL-1水平的变化

注：与假手术组比较,aP<0.05;与ANP组比较,bP<0.05

五、回肠组织IκBα蛋白水平的变化

假手术组3、6、12 h的 IκBα蛋白表达量分别为25.17±0.56、24.32±1.93、24.01±1.12；ANP组为4.46±1.45、3.30±1.99、3.36±1.23；莫沙比利组为7.46±3.57、4.54±1.67、5.43±4.09；八面蒙脱石组为6.23±3.12、4.11±1.47、3.13±2.96；联合组为17.35±0.95、15.99±1.26、18.23±1.94。ANP组与莫沙比利组及八面蒙脱石组无明显差异；联合组较上述3组均明显增加(P值均<0.05，图5)。

图3假手术组(a)、ANP组(b)、莫沙比利组(c)、八面蒙脱石组(d)和联合组 (e) 6 h点的回肠组织超微结构变化( ×4000)

图4假手术组(a)、ANP组(b)、莫沙比利组(c)、八面蒙脱石组(d)和联合组 (e) 6 h点的回肠黏膜组织NF-κB 的活化状况( ×20)

图5 各组回肠组织IκBα蛋白表达

讨 论

文献报道[5-7]，八面蒙脱石可通过自身与肠黏液分子间的相互作用，增加黏液的内聚力、粘弹性和存在时间，从而保护肠细胞顶端和细胞间桥免受损坏，促进上皮细胞再生和修复，同时可以覆盖在消化道黏膜表面，加强由黏液免疫球蛋白A和正常菌群组成的黏膜防御屏障，恢复肠上皮细胞的正常吸收分泌功能。但其在SAP时的应用尚未见报道。因急性胰腺炎时小肠动力功能减退[8]，导致药物无法顺利到达肠道发挥作用，为此，本文联合应用促胃肠蠕动剂莫沙必利，以保证八面蒙脱石到达肠道充分发挥药物作用。实验结果显示，联合组大鼠回肠绒毛高度和柱状细胞指数均显著高于ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组，而与假手术组无显著差异，提示联合应用莫沙必利和八面蒙脱石能减轻肠黏膜的损伤。

NF-κB在全身炎症反应综合征(SIRS)的发生过程中起着核心作用，调节多种炎症介质的基因转录[9]。本实验结果显示，联合组NF-κB活化较ANP组、莫沙必利组和八面蒙脱石组显著减少，而IκBα蛋白显著增加，表明联合应用莫沙必利和八面蒙脱石才能保证八面蒙脱石抑制NF-κB活化的作用。

研究证实，NF-κB对TNF-α的表达具有调节作用[10]。而TNF-α又可激活IL-1、IL-6、IL-8、白细胞趋化因子、黏附分子等细胞因子。本实验联合组大鼠血TNF-α和IL-1的水平均明显较ANP组、莫沙必利组、八面蒙脱石组下降，可能与八面蒙脱石减少了NF-κB的大量活化有关。

此外，当联合给予八面蒙脱石和莫沙必利灌胃后，除了回肠组织损伤好转外，胰腺的病理损伤也减轻，表明八面蒙脱石同样能减轻胰腺的损伤。

[1] Deitch EA，Bridges W，Baker J，et al．Hemorrhagic shock-induced bacterial translocation is reduced by xanthine oxidase inhibition or inactivation．Surgery，1988，104：191-198.

[2] Ikeda H,Suzuki Y,Suzuki M,et al.Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischaemia and ischaemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium.Gut,1998,42:530-537.

[3] 胡彩虹,夏枚生,熊莉,等. 蒙脱石对细菌黏附Caco-2细胞的影响. 细胞生物学杂志.2006，28：76-78.

[4] 许永春,李兆申,屠振兴,等. 改良逆行胆胰管注射法制备轻重不同两种大鼠急性胰腺炎模型. 第二军医大学学报，2004，25：1251-1252.

[5] 陈春谦，金有豫，汤光. 新编药物学.15版.北京: 人民卫生出版社,2003:462.

[6] 朱玲. 思密达联合得舒特治疗腹泻型肠易激综合症疗效观察. 中国现代医药杂志,2008,10:127.

[7] 梁若玲. 思密达治疗肠易激综合症疗效观察. 胃肠病学和肝脏病学杂志,2001,10:117.

[8] Van Minnen LP, Blom M,Timmerman HM,et al. The use of animal models to study bacterial translocation during acute pancreatitis. J Gastrointest Surg, 2007,11: 682-689.

[9] 张喜平，陈林杰.NF-kB及其在急性胰腺炎中的作用.医学研究杂志，2007，36：17-20.

[10] Wang YL, Zhang SD，Zheng YJ,et al. Effects of gut barrier dysfunction and NF-kappaB activation on aggravating mechanism of severe acute pancreatitis. J Dig Dis,2009,10:30-40.

2009-03-31)

(本文编辑：屠振兴)

RoleofoctahedralmontoneandmosaprideonileumNF-κBactivationinratswithacutenecrotizingpancreatitis

XUJuan-juan,PENGJing-jing,HUGeng-cheng,QIANWei,DINGZheng,LIUJun,HOUXiao-hua.

DepartmentofGastroenterology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

LIUJun,Email:liujun-99@126.com

ObjectiveTo investigate the role of octahedral montone on ileum NF-κB activation in rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP).Methods120 SD rats were randomly divided into sham-operation group (A), ANP group (B), mosapride treatment group (C), montone treatment group (D), montone and mosapride treatment group (E). Retrograde pancreatic duct injection of sodium taurocholate was used to establish ANP models, octahedral montone and mosapride were given by intragastric feeding 30 min before ANP model induction. group A was injected NS after opening the abdomen. Pancreatic tissue injury was evaluated; the serum level of TNF-α and IL-1 was determined; the ultrastructural changes of the ileum was observed.The expression of NF-κB in the ileum mucosa was detemined by immunohistochemistry. The expression of IκBα protein in the ileum tissue was determined by Western blotting.ResultsCompared with group A, pancreatic tissue injury was more severe in group B, and serum level of TNF-α and IL-1 was much higher in group B[(36.79±1.14)vs(9.00±0.01)pg/ml, (25.17±1.93)vs(3.45±0.11)ng/ml,P<0.05]; the height of the villi was significantly lower [(0.25±0.22)×10-6mvs(1.50±0.33)×10-6m,P<0.05)], the index of columnar cell was significantly lower [(2.40±1.65)×10-6mvs(13.5±4.28)×106/m,P<0.05)]; the expressions of NF-κB was significantly eleveted (6.92±1.54vs1.28±0.29,P<0.05), the expressions of IκBα protein was significantly decreased (3.30±1.99vs24.32±1.93). There was no significant difference between group D and C. The serum level of TNF-α and IL-1 [(30.57±0.39)pg/ml and (13.45±1.26)ng/ml], the height of the villi and the index of columnar cell [(1.05±0.28)×10-6m and (10.10±2.50)×106/m] and the expressions of NF-kB (4.3240±1.5657) and IκBα (15.987±1.262) was statistically significantly different compared with those of the ANP group (P<0.05).ConclusionsOctahedral montone and mosapride could decrease the NF-κB activation and ameliorate the inflammation of ileum and pancreas during the course of ANP.

Pancreatitis, acute necrotizing; NF-κB; IκBα; Ileum; Octahedral montone; Mosapride

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.015

430022 武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科

刘俊，Email: liujun-99@126.com