猪流感(H1N1H3N2亚型)二价灭活疫苗试制报告

王家福,刘尚高

(1.中国农业大学动物医学院,北京 海淀100193;2.宁波天邦股份有限公司,浙江 余姚315400)

猪流行性感冒(swine influenza,SI)是由猪流行性感冒病毒(SIV)引起的猪的一种急性、热性和高度接触性的呼吸道传染病,其临床上以突发高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭和死亡为特征[1]。猪流感呈地方性流行,世界分布,可发生于各年龄和各品种猪,发病率可高达100%[2]。猪是禽流感、猪流感、人流感病毒共同的易感宿主,三种病毒极易发生重组、变异,产生新的毒株危害人畜生命及安全。因此,猪流感在人和动物流感的病原学、生态学及流行病学中占有相当重要的地位[3]。对猪流感的防制不仅可以减少对养猪业造成的直接经济损失,而且也能降低出现其他新流感病毒的可能性,采用疫苗来预防猪流感,是降低损失和出现新流感病毒可能性的主要措施之一[1]。国外已研制出了灭活疫苗,弱毒疫苗,亚单位苗,并在开展基因工程苗的研制工作[5]。国内尚无正式上市的疫苗。

1 材料与方法

1.1 种毒 自 2002年开始,先后从河北、河南、山东、黑龙江、江苏、安徽、内蒙等地送检的病猪呼吸道病料以及暴发SI的病猪群内采集症状典型或病死猪的鼻气管、分泌物用PBS制成悬液,以3 000 r/min离心20 min,吸取上清,加双抗摇匀灭菌处理,作为接种材料并做无菌检验,合格者接种10日龄SPF鸡胚,35℃孵育,盲传3代,收集尿囊液进行血凝活性测定。血凝活性HA≥1∶128即可进行病毒鉴定。

对上述毒株作了系统的鉴定工作,如理化特性、血清学鉴定、特异性鉴定、电镜观察、外源病原检测、抗原相关性试验,并经中国疾病预防控制中心病毒预防控制所国家流感中心进行血凝素(H)、神经氨酸酶(N)的系统鉴定,证明它为猪流感H 1N1、H 3N2亚型,分别定名为L、S毒株。

经测定,其 EID50≥107.5/0.1 mL。HI抗体几何平均值≥7log2,病毒分离,对照组至少4/5病毒分离阳性,免疫组全部保护。经特异性和纯净性检验合格。

1.2 试验猪 SIV H1N1、H 3N2亚型 HI抗体均为阴性的2月龄仔猪,购自武川县畜牧局猪场。

1.3 鸡胚 SPF鸡胚,发育良好的10日龄非免疫易感鸡胚。

1.4 浓缩、乳化设备 并联分体式浓缩超滤装置、胶体磨JTM 50、匀浆泵。

1.5 其他 药用白油、司本-80、硬脂酸铝。

1.6 毒液制备 按规程草案规定的生产工艺接种收获胚液并按照“标准”附录P.301的方法对胚液进行无菌检查,应无细菌生长。对10日龄易感鸡胚尿囊腔内接种EID≥107.5/0.1 mL,胚液对1%鸡红细胞凝集价≥1∶256。符合以上规定的方可作为制苗用病毒液。

1.7 抗原浓缩 取2种制苗用毒液,分别在无菌条件下过滤,除去尿囊液残渣和其他粗颗粒杂质。然后分别进行浓缩。浓缩前和浓缩后,用测血凝价HA或 EID50方法进行检查,确定浓缩终点是EID50≥5×108.0/0.1 mL。浓缩后的病毒应达到浓缩终点的要求,对浓缩过程中的废弃液进行检查,检查其EID50、HA价或TCID50等均应为零值。

1.8 灭活 经浓缩后的2种病毒液,分别加入0.1%分析纯甲醛,经37℃16 h灭活处理。灭活后的病毒液,分别接种SPF鸡胚,进行 HA、EID50测定。同时按“标准附录”P.301的方法作无菌检验。

1.9 乳化与分装 2种抗原液按1∶3(水相∶油相)比例先分别乳化成单项苗。再将单项苗等体积混合,经匀浆机充分混合均匀,即成二价苗。分装、加塞、压盖,2℃～8℃保存。

1.10 疫苗检验

1.10.1 物理性状 剂型：将3批三价苗滴于冷水表面,不分散为W/O型,分散为O/W型。

黏度：用出口内径为1.2 mm的1 mL吸管,在室温条件下吸1 mL二价苗,计算垂直放出0.4 mL所需的时间。

稳定性：将二价苗以3 000 r/min离心15 min,观察疫苗分层情况。或将二价苗分别置4℃冰箱,室温(20℃～25℃以下),37℃温度条件下观察分层情况。

1.10.2 无菌检验 按“生物制品质量标准”附录P.301的方法对3批二价苗进行无菌检验,并观察结果。

1.10.3 安全试验 用 2月龄SIV(L、S株)抗体阴性的仔猪,肌肉注射二价苗6 mL,观察3周,并记录试验猪的反应情况。

1.10.4 效力检验 每批疫苗接种2月龄SIV抗体阴性仔猪5头,每头肌肉注射疫苗2.0 mL,同时设同条件下不接种疫苗的对照仔猪5头,21 d后采血,分离血清,用SIV亚型抗原测定HI抗体效价,免疫组HI抗体几何平均滴度应≥7log2,对照组均为阴性。或将上述各组仔猪于免疫28 d后,用SIV亚型强毒,经10倍稀释,每头仔猪滴鼻和肌肉注射2.0 mL,攻毒5 d后,采集鼻腔拭子进行病毒分离。每头仔猪的样品尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚5个。孵育观察5日,无论死胚、活胚均应测定鸡胚液血凝价,以5个鸡胚中至少有1个鸡胚的血凝价≥1∶16判为感染。观察并记录结果,对照组至少4头分离到病毒,免疫组应完全保护。

1.10.5 不同免疫剂量试验 3批苗分别各用1、2、3、4 mL肌肉注射2月龄SIV抗体阴性仔猪。同时设不免疫对照组。1个月后,对免疫猪和对照猪用L、S强毒株(EID50≥107.5/0.1 mL)2 mL鼻腔滴鼻和肌肉注射,1周后两组仔猪采鼻腔拭子、用SPF鸡胚分离病毒。判定。

2 结果

2.1 毒液制备 制备出符合要求的SIV 2种亚型毒液。经测定,2株鸡胚尿囊液的病毒含量≥107.5EID50/0.1 mL,HA≥1∶256;2种病毒液经无菌检验均无菌生长,符合制苗的要求。

2.2 毒液浓缩 浓缩后的毒液采用检查EID50和HA效价的方法,证明浓缩效果明显,HA≥2 048,均提高了16倍;废弃排放液中均不含病毒。

2.3 毒液灭活 灭活后的病毒液,分别接种SPF鸡胚,进行HA、EID50测定,均未引起鸡胚死亡,其EID50和HA均为0,证明鸡胚液均无血凝活性和致病性,病毒已彻底灭活。

2.4 乳化分装 灭活的病毒液按照水相：油相1∶3比例,分别乳化后再混合,制备出理想的二价灭活疫苗。

2.5 检验

2.5.1 物理性状 剂型：3批样品分别滴于冷水表面,不分散,为W/O(油包水)型。

黏度：用出口内径1.2 mm的1 mL吸管,在室温条件下吸1 mL二价苗,垂直放出0.4 mL所需的时间分别为7～8 s,符合“质量标准”要求。

稳定性：3批苗以3 000 r/min离心 15 min,不分层、不破乳。在4℃保存13个月,20℃以下保存6个月,疫苗不分层;37℃保存1个月不分层;保存2个月疫苗表面有2 mm左右的油层,摇荡后即成均匀的乳剂。

2.5.2 无菌检验 无菌检验结果所制3批试验疫苗均无菌生长,均合格。

2.5.3 安全试验 观察3周,所有试验仔猪精神良好,吃食正常。3周后扑杀,观察注射部位、肾脏、气管及内脏的变化,所有脏器未见异常变化,少数仔猪注射局部有轻微炎性反应,或有少量未吸收疫苗。证明该3批试验疫苗使用安全。

2.5.4 效力试验 免疫仔猪均为阴性,而对照仔猪病毒分离至少4头阳性。结果见表1。

表1 效力检验结果

2.5.5 不同免疫剂量试验 1 mL免疫总保护为33.3%。2 mL免疫总保护100%。3 mL免疫总保护为100%。4 mL免疫总保护100%。而对照组为0%,并分离到病毒。因此,最小有效免疫剂量仔猪定为2 mL,大猪定为3～4 mL。结果见表2。

表2 不同免疫剂量试验结果

3 结语

3.1试制成功猪流感2个亚型毒株二价灭活疫苗。从该疫苗经物理性状检验、无菌检验、安全检验和效力检验结果看,2个制苗种毒的免疫原性和稳定性良好,适合作疫苗用毒株。所设计的生产工艺简便易行,适合于规模化生产。疫苗符合“试行规程”(草案)规定。

3.2 生产工艺中的浓缩技术先进,效果稳定。浓缩过程中随时抽样检测滤出液的HA效价,并将浓缩即将完成时的滤出液接种鸡胚检测有无活病毒滤出,结果表明,浓缩过程中没有抗原成分损失。从浓缩前后胚液中抗原含量检测结果看,HA效价与浓缩倍数成正相关;EID50均有所提高。用浓缩后的胚液配苗,疫苗中抗原成分的含量均可达到或高于相应单苗的标准。

[1] Barbara E Strawt.猪病学[M].赵德明,张仲秋,沈建忠,主译.9版.北京：中国农业大学出版社,2008：522-523,528-530.

[2] Marozin S,Gregory V,Cameron K.Antigenic and gengtic diversity among.swine influenza A H1N1and H1N2viruses in Europe[J].Gen Virol J,2002,83：735-736.

[3] Nerome K,Yoshioka Y,Sakamoto S.Characterization of a 1980-Swine recombinant influenza virus possessing H1 haemagglutinin and N2 neuraminidase similar to that of the earliest Hong Kong(H3N2)virus[J].Arch Virol,1985,86：197-199.

[4] Swenson S L,Foley P L,Swine influenza.In Manual of Diagnostic Tests and Vaccinesfor Terreststrial Animals[M].Office International des Epizooties.World Organisation for Animal Health,2004：1111-1112.