肌肉注射盐酸头孢噻呋混悬注射液对猪安全性试验

郭桂芳,梁先明,杨大伟,曾繁活,赵永达,倪恒佳,曾振灵,徐士新,黄显会

(1.中国兽医药品监察所,北京海淀100081;2.华南农业大学兽医学院,广东广州510642)

头孢噻呋(ceftiofur)是第一个畜禽专用的第3代头孢菌素类抗生素,具有抗菌谱广、抗菌活性强、对胃酸和β-内酰胺酶较稳定、过敏反应少、毒性小、在动物体内残留低的特点[1]。国内外已批准的制剂有注射用头孢噻呋钠和盐酸头孢噻呋注射液,用于肉牛、奶牛、马、羊、猪呼吸道病和1日龄鸡细菌性感染的防治[2]。近年来,美国辉瑞动物保健公司又开发了一种新剂型的头孢噻呋,即结晶性头孢噻呋游离酸(ceftiofur crystalline freeacid,CCFA),随后对该药的临床疗效做了大量研究[3-4]。在我国山东鲁抗等公司已被批准生产头孢噻呋,国内也有过关于头孢噻呋混悬剂的应用研究[5]。本课题组研制成功的长效头孢噻呋混悬注射液,稳定性好,缓释效果显著,为头孢噻呋的兽医临床应用提供了一种新的药物剂型[6]。本试验对长效头孢噻呋混悬注射液在靶动物猪体内进行了安全性试验,为其临床上安全用药提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 盐酸头孢噻呋混悬注射液,含量为10%,规格 10 mL∶1g,批号：20070701,上海公谊兽药厂中试生产;血清生化指标测定试剂,四川省迈克科技有限责任公司生产;其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备 MEK-6138K全自动血液学分析仪(日本光电工业株式会社生产);魅力1800自动血液生化分析仪(美国MD仪器公司)。

1.3 试验动物 20头健康二元杂交猪(公母兼有),40日龄左右,体重43.61 kg±1.49 kg,由广东省种猪场提供,自由饮水,饲喂不含任何药物的全价饲料,每天定时给料2次。给药前饲喂1周,适应环境。

1.4 试验分组、给药与样品采集 试验动物随机分为4组,每组5头。设1组为空白对照组,其余为低、中、高3个给药组。给药组动物按照推荐给药剂量(5 mg/kg体重)、3倍推荐给药剂量(15 mg/kg体重)和5倍推荐给药剂量(25 mg/kg体重),通过颈部深层肌肉注射盐酸头孢噻呋混悬注射液(10%),按照推荐给药方案,连续给药两次,给药间隔72 h。给药后每天观察动物的临床变化情况(行为特征、呼吸、采食、精神状况等)。

所有动物分别在给药前、第1次给药后1 d、第2次给药前及第2次给药后1、5、10、15 d分别称重、测体温(肛温)并采集血液10 mL,分两管,分别制备全血(加抗凝剂EDTA-K2)和分离血清(不加抗凝剂,2 500 r/min离心5 min)。

1.5 样品分析 采新鲜抗凝全血,进行白细胞(WBC)计数、红细胞(RBC)计数、血小板(PLT)计数、平均红细胞容积(MCV)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)等项目分析。

制备血清,进行肌酐(CREA)、血糖(GLU)、谷草转氨酶(GOT)、白蛋白(ALB)、血清尿素氮(BUN)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(GPT)、总胆固醇(T-CHO)等项目进行分析。

1.6 病理组织学检查 在第15天时宰杀空白组与高剂量组试验猪,先进行肉眼观察,采集多种组织器官(肝、肾、心脏、脾脏、脑组织等),10%中性福尔马林中固定,制作病理切片,进行组织病理学观察。

1.7 数据处理 试验数据用EXCEL软件进行处理后,采用SPSS 16.0统计分析软件进行One-Way ANOVA分析,比较试验组与对照组间各指标差异显著性,试验数据结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 临床表现 与未给药前相比,所有动物给药后每天观察2次,盐酸头孢噻呋各剂量组和空白对照组进食正常,行动正常,呼吸和排泄未见异常,注射部位也未见红肿。试验猪体温和体重组间比较差异均不显著(P＞0.05)。临床表现均正常。

2.2 血液常规指标分析 血液常规结果见表1。在整个试验期间内,各组别猪在不同时间点采集的血液所测定的各项指标均在正常参考范围之内。且盐酸头孢噻呋混悬注射液高、中、低剂量组与空白对照组相比,并无显著性差异(P＞0.05)。因此盐酸头孢噻呋混悬注射液在5～25 mL/kg剂量范围对血液常规指标无明显的影响。

表1 猪肌肉注射盐酸头孢噻呋混悬注射液(10%)后血常规指标 (平均值,n=5)

2.3 血清生化指标分析 血清生化检测结果见表2。除 GLU外,其余各项指标GOT、CREA、GLU、GPT、ALB、BUN等空白对照组相比差异不显著(P＞0.05)。给药后1～5 d,中、高剂量组与对照组相比差异显著(P＜0.05),低剂量组与对照组相比无显著性差异(P＞0.05)。到第2次给药后10 d,中、高剂量组的GLU值恢复到正常水平,与对照组相比无差异(P＞0.05)。

表2 猪肌肉注射盐酸头孢噻呋混悬注射液(10%)后血清生化指标 (平均值,n=5)

GPT、ALP、GGT、TP、ALB、TBIL 为常用的肝功能检测指标;GOT、LDH和CK为心脏功能指标;BUN、CREA、UA是肾功能的重要指标。本试验中,各剂量组的 GPT、GOT、ALP、ALB、BUN、CREA的平均值与对照组的平均值均无显著差异,故可以认为盐酸头孢噻呋混悬注射液对猪的肝、肾、心脏功能无损害。TC、TG反映动物机体内脂代谢的情况,可作为判断高脂血症和营养不良指标。GLU的浓度受多种因素的影响。胰岛素,胰高血糖素,肾上腺素,生长激素等都影响血糖浓度的改变。试验中,各剂量组的TC、TG值与对照组无差异,表明注射液对猪的脂代谢无影响。而中、高剂量组的GLU值在第2次给药后的1～5 d显著降低,到10 d后逐渐恢复到正常水平,估计是注射液对胰岛素的分泌产生影响而引致的,且这种影响是可逆的,具体的影响机理还有待进一步试验证明。因而总体说明盐酸头孢噻呋混悬注射液在5～25 mL/kg剂量范围对血液常规指标没有明显的影响。

2.4 病理组织学检查分析 宰杀后经肉眼观察,高剂量组猪的心肌、肝脏、脾脏、肺、肾、胃、胰腺、淋巴结、脊髓、大脑、小脑等器官组织表面没出现明显的病理变化。H.E.染色后观察,两次给药后,高剂量组的心肌、肝脏、脾 脏、肺、肾、胃、胰腺、淋巴结、脊髓、大脑、小脑、肌肉等均未见明显病理变化。

肝是体内最大的腺体,有分泌胆汁、合成体内血浆蛋白、脂蛋白、胆固醇、糖原等重要物质,储存糖原、维生素,解毒及参与体内防卫体系的功能。在肝切片中可以看到清晰的肝小叶界限和位于小叶中央的中央静脉,肝细胞以静脉为轴心,呈放射状排列。肺是吸入空气与血液中的二氧化碳进行交换的场所。在肺组织切片中可见呈半球形的肺泡,一端开口于肺泡囊、肺泡管或呼吸性细支气管,另一面借肺泡隔与相邻肺泡连接;多个肺泡围成的肺泡囊,是多个肺泡共同开口的通道,相邻的肺泡由扁平细胞形成的肺泡壁分隔开。在高剂量组的病理切片中,肝脏、肺均没有发生病理变化。肝脏和肺脏病理切片见图1～4。

图1 空白组猪的肝组织切片(H.E.40×)

3 结语

长效盐酸头孢噻呋混悬注射液由盐酸头孢噻呋和注射用茶油等辅料制作成的混悬制剂。通过对猪连续2次肌肉注射给药,并进行临床症状、血液生理生化指标对比分析,与给药前相比,所有动物给药后采食和行动正常,呼吸和排泄也未见异常,注射部位未见肿块等现象,临床表现均正常。在5～25 mg/kg体重剂量范围内,肌肉注射盐酸头孢噻呋混悬注射液,对猪血液常规指标和生理生化指标无明显影响。表明按此处方生产的盐酸头孢噻呋混悬注射液在临床使用中按“肌肉注射,每千克体重,猪5 mg,每3天给药1次,连续给药2次”的用法和用量使用,安全,无明显不良反应。

[1] 陈杖榴.兽医药理学[M].3版.北京：中国农业出版社,2009.

[2] 王慧,陈小军,刘伟,等.动物专用头孢噻呋[J].动物医学进展,2009,30(1)：104-108.

[3] Van Donkersgoed J,Dussault M ,Knight P,et al.Clinical efficacy of a single injection of ceftiofur cry stalline f ree acid sterile injectable suspension versus three daily injections of ceftiofur sodium sterile powder for t he treatment of foot rot in feedlot cattle[J].Vet Ther,2008,9(2)：157-162.

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[5] 司红彬,莫娟,潘玉善,等.头孢噻呋混悬注射液的研制及疗效试验[J].河南农业大学学报,2008,42(1)：71-76.

[6] 曾繁活.长效盐酸头孢噻呋注射液在猪的药动学及组织残留研究[D].广州：华南农业大学,2009.