Protollin黏膜免疫佐剂的研制

孙 晴

(临沂师范学院生命科学学院,山东临沂276005)

在人和动物的机体内存在着完整的黏膜免疫系统。黏膜免疫要取得好的免疫效果,关键是免疫佐剂的使用。比较理想的黏膜佐剂应高效、安全,能激活黏膜免疫系统[1]。Protollin黏膜佐剂是由福氏2a痢疾杆菌中提取的脂多糖(LPS)[2]与B群2b型脑膜炎奈瑟双球菌的外膜蛋白中提取的蛋白体[3]非共价结合制备而来的。蛋白体具有免疫佐剂作用,主要原因是蛋白体中的主要成分PorB(Ⅱ类膜蛋白)可与Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)相互作用。TLRs能够识别侵入体内的微生物进而激活免疫细胞应答[4]。被认为在先天性免疫系统中起关键作用。而福氏2a痢疾杆菌的LPS可与Toll样受体4相互作用,也能调节天然免疫。所以研究制备Protollin黏膜佐剂具有非常重要的现实意义[7]。

1 材料

1.1 主要试剂 酚(AR),由天津市化学试剂厂生产;蒽酮(AR),中国医药上海化学试剂公司生产;BCA蛋白浓度检测试剂盒,购于碧云天试剂公司。

1.2 菌种及诊断液 福氏2a痢疾杆菌、福氏2a痢疾杆菌群Ⅱ型诊断血清和蛋白体(由B群2b型脑膜炎奈瑟双球菌29353菌株提取),由临沂师范学院预防兽医学实验室保存。

1.3 实验动物 Balb/c小鼠,雌性,6～18周龄。购自山东临沂鲁南制药厂实验动物中心。

2 方法

2.1 LPS的提取方法 采用热酚水法,方法步骤见参考文献[6]。

2.2 LPS的脱毒[3]及检测[4]LPS的脱毒检测用14%SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳银染色法。

2.3 LPS中某些物质的检测

2.3.1 蛋白质含量的测定 用牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白,系列稀释,具体操作参照BCA法试剂盒说明书,然后做标准曲线,测出LPS提取物的OD值,从标准曲线找出其蛋白含量。

2.3.2 糖含量的测定[8]取一定量的LPS,用蒽酮法从标准曲线中找出其糖含量。

2.4 异常毒性试验 将体重20 g左右的Balb/c小鼠18只随机分成3组,每组6只,分别称重。1、2两组分别腹腔注射0.5 mL含1 mg和2 mg的LPS,第3组设为对照组,腹腔注射0.5 mL生理盐水,连续观察14 d。在观察期内小鼠应全部健存,无异常反应,每只小鼠体重增加,判为合格。

2.5 蛋白体的提取及鉴定 见参考文献[3]。

2.6 Protollin佐剂的制备[5]将去毒的LPS溶于TEEN缓冲液中,与等量的蛋白体混合,加入4倍体积的冷无水乙醇,收集沉淀,再用无水乙醇洗3次,最后用无菌蒸馏水溶解,超声使蛋白体与LPS相互结合和溶解,溶液 1 000 r/min离心10 min,去除不可溶的物质,可溶的为Protollin佐剂。

2.7 Protollin佐剂效果试验

2.7.1 免疫双扩试验[3]。

2.7.2 动物试验 选6～18周龄Balb/c小鼠,雌性,随机分为 3组,每组 5只,Protollin+YscF组：每只15μL YscF+5μL Protollin;Protollin对照组：5μL Protollin;YscF 组：每只 15μL YscF。所有小鼠滴鼻初免后每隔7 d加强免疫1次,共免疫3次,每次免疫后第7天尾静脉采血,用ELISA方法检测抗体滴度。

3 结果与分析

3.1 LPS脱毒检测结果 从SDS-PAGE银染色(见图1),福氏2a痢疾杆菌LPS有两条条带,分别是85 ku和43 ku。而泳道1为脱毒LPS未见到明显的染色条带。说明将福氏2a痢疾杆菌LPS经脱毒得到LPS中不含类脂A部分。在Protollin中也没有LPS条带,只有蛋白体条带。

图1 SDS-PAGE银染色图

3.2 LPS与 Protollin中某些物质的检测 经SDS-PAGE检测脱毒LPS蛋白质含量为0.024 g/L;糖含量为0.34 g/L。Protollin佐剂中多糖含量为0.357 g/L,蛋白质含量为0.517 g/L均符合生物制品安全标准要求。

3.3 Protollin佐剂效果

3.3.1 免疫双扩试验 脱毒后的LPS和Protollin佐剂分别与福氏2a痢疾杆菌群Ⅱ型血清能形成明显的沉淀线,说明脱毒后的LPS和Protollin佐剂均保存了LPS良好的反应原性。

3.3.2 动物试验 结果显示(见图2)：在免疫接种2周和4周后检测Yscf+Protollin组的抗体滴度明显高于 Yscf组和Protollin对照组。说明制备的Protollin佐剂具有良好的免疫效果,且能够增强Yscf的免疫原性。

图2 Protollin佐剂免疫小鼠后血清IgG抗体滴度

4 讨论

4.1 福氏2a(S.f lex neri 2a)痢疾杆菌是一种致病菌,从中提取LPS用作疫苗佐剂的成分,其安全性是首要的。本试验严格按照《中国生物制品规程》的各项要求对 LPS进行安全性检测。所获得的LPS其纯度均符合要求[9]。将福氏 2a痢疾杆菌LPS与纯化后的蛋白体佐剂非共价结合制成Protollin佐剂,保持了多糖完好的反应原性。

4.2 本试验对制备的Protollin佐剂作进一步的动物学试验和抗体滴度检测,结果证明,制备的Protollin佐剂具有良好的免疫活性,能够增强Yscf的免疫原性。Protollin佐剂的安全性在文献[10]中证实,通过鼻内免疫啮齿类动物和灵长类动物的试验,证明疫苗是安全,无毒性,有持久效果,并且具有很高的免疫原性和免疫保护效果。所以Protollin佐剂将成为一种很有潜力的黏膜佐剂。随着研究的深入将会在传染性疾病的防治中发挥广泛而重要的作用。

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