妊娠期雌性大熊猫尿中生殖激素的初步研究

刘学锋,普天春,原 蕾,张成林,张金国,彭真信,王泽重,施振声

(1.北京动物园,北京西城100044;2.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

成年雌性大熊猫一般每年春季发情1次,自配种后,受精卵并不是立即着床发育,而是在子宫内游离一段时间,再选择适宜的时机着床,受精卵附着在子宫壁后迅速发育,经2～3个月便分娩而出。这是该物种的独特现象,对此自20世纪80年代起,人们开始利用各种技术进行研究,如利用放射免疫[1-3]和酶联免疫法[4]对妊娠期孕酮值的监测,采用E-玫瑰花环试验检测大熊猫早孕因子[5],检测大熊猫绒毛膜促性腺激素[6-7],这些研究结果表明,大熊猫存在“胚胎延迟着床现象[8]”。

本文通过利用传统的放射免疫方法,测定妊娠期雌性大熊猫“妞妞”尿中的孕酮、雌二醇、雌三醇和绒毛膜促性腺激素值,通过激素的曲线变化来分析推断胚胎着床时间,从胎盘激素变化上区分“真孕”和“假孕”。

1 材料与方法

1.1 试验动物 北京动物园饲养的大熊猫“妞妞”,1995年9月5日出生,雌性,谱系号 421。2003年曾生产1胎1仔。2008年3月初发情,19日与雄性大熊猫“古古”自然本交成功,21日人工授精1次,精液提供者为大熊猫“大地”。2008年7月23日突发疾病死亡,造成妊娠中断。剖检发现子宫内胎儿发育到葡萄珠大小,口鼻眼及四肢都能明显分辨,两耳间至尾根3.1 cm,头长0.8 cm,尾长0.6 cm。

1.2 收集尿液 在配种后每日收集新鲜干净的尿液,每次5 mL,置于塑料管中,-20℃冻存待测。

1.3 激素测定

1.3.1 尿样的处理 新鲜尿样直接检测;低温冻存尿样冰水浴溶解后恢复至室温检测。

1.3.2 测定方法 尿液孕酮、雌二醇、雌三醇和绒毛膜促性腺激素的检测均使用北京科美东雅生物技术有限公司生产的放射免疫分析试剂盒、合肥众成GC2010放射免疫γ计数仪进行测定。

尿液肌酐检测用北京科美东雅生物技术有限公司生产的肌酐(苦味酸法)试剂盒、日本日立7080生化分析仪进行测定。

1.3.3 数据处理 孕酮、雌二醇、雌三醇和胎盘促性腺激素(CG)的测定数据均利用肌酐值进行校正,以消除可能带来的误差,所得尿液中激素浓度是放射免疫测定结果与同一样品的肌酐(Cr)含量的比值,除雌二醇用 pg/mg Cr表示外,其余均用毫微克/毫克肌酐(ng/mg Cr)表示,即每毫升尿样中所含激素量与毫克肌酐量的比值。

单位换算：Cr的单位：μmo l/L。1 m g/d L=88.4μmol/L或1 mg/dL=0.01mg/mL。

2 结果

2.1 孕酮(P) 孕酮由黄体及胎盘等产生,在妊娠期抑制子宫的自发活动,降低子宫肌层的兴奋作用,还可促进胎盘发育,维持正常妊娠。

图1 大熊猫“妞妞”配种后的孕酮变化

2.2 雌二醇(E2) 雌激素主要产生于卵巢、胎盘、肾上腺、睾丸等部位,主要形式是雌二醇,具有促进雌性动物的发情表现和生殖道生理变化的作用,有的动物(如猪),胚泡产生雌激素作为妊娠信号,有利于妊娠的建立[9]。

图2 大熊猫“妞妞”配种后的雌二醇变化

2.3 雌三醇(E3) 一般情况下是雌二醇的代谢产物,在妊娠期雌三醇(E3)主要由胎儿与胎盘合成,可调节子宫肌运动;抑制PGF2∝合成;对子宫颈、阴道和外阴增生活性的刺激作用比雌二醇和雌酮明显,可降低血液促性腺激素含量[9]。

图3 大熊猫“妞妞”配种后的雌三醇变化

2.4 绒毛膜促性腺激素(CG) 绒毛膜促性腺激素主要由胎儿胎盘产生。

图4 大熊猫"妞妞"配种后的CG变化

3 讨论

3.1 大熊猫配种后受精卵有“延迟着床‘现象,胚胎着床后的真正发育时间很短,仅为50～70 d[10],造成大熊猫妊娠期差异大(76～324 d)的原因在于胚胎着床时间,所以判断胚胎着床时间具有非常大的意义。本研究测定的孕酮值开始升高的时间在配种后78 d,开始升高的时间和CG是相同的,由此推断受精卵着床时间在配种后78 d,即6月7日,此前受精卵在子宫内一直处于游离状态。本研究从胎盘激素变化角度验证该物种受精卵的“延迟着床”现象。

3.2 本研究测定了大熊猫配种后尿中的激素E3,其变化出现在配种后86日,趋势呈跳跃式升高,其变化显示该个体已经受孕并胎儿开始发育。胎盘合成E3的前身物质脱氢表雄酮硫酸酯(DHEAS)主要来源于胎儿肾上腺和肝,DHEAS在胎盘芳香化酶的作用下转化为雌激素,人们将妊娠期E3的合成依赖于胎儿的前体供应和胎盘的转化功能称之为胎儿-胎盘单位功能。E3在人类孕妇检查胎盘功能时经常使用,妊娠期E3值持续低水平,易发生胎儿停育或新生儿窘迫,如本例后期。

3.3 本研究由于该妊娠个体突然发病死亡,造成妊娠中断,致使妊娠后期数据不完整,但在研究后期,E3和CG的值连续出现下降的情况是否显示该妊娠个体出现疾病,应引起我们在今后的研究中重视。图5为大熊猫“妞妞”配种后123日死亡时的胎儿形态：口鼻眼及四肢都能明显分辨,两耳间至尾根3.1 cm,头长0.8 cm,尾长 0.6 cm 。

图5 大熊猫“妞妞”胎儿照片

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[3] 谢钟,刘维新,刘农林.大熊猫尿中雌二醇、孕酮含量周期性变化的初步研究[C]//成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集,成都：四川科学技术出版社,1998：238-242.

[4] 李学兵,刘选珍.酶联免疫法测定尿中孕酮和PdG进行大熊猫妊娠诊断[C]//成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集,成都：四川科学技术出版社,1998：105-108.

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[6] 陈玉村,陈玉华,陈元枝,等.大熊猫繁殖生物学初步研究[C]//大熊猫繁殖与疾病研究,成都：四川科学技术出版社,1991：78-83.

[7] 刘维新,谢钟,刘农林,等.大熊猫妊娠生理的初步研究[C]//成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集,成都：四川科学技术出版社,1998：119-123.

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[9] 朱士恩.动物生殖生理学[M].北京：中国农业出版社,2006.

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