补肺益寿合剂Ⅱ治疗肺阴虚证的研究*

王 煜，张竹君，张丽君，王 炯，张参军

(1.甘肃省中医院，甘肃 兰州730050;2.甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州730050)

补肺益寿合剂是全国名老中医王自立主任医师集数十年临床经验方。王老遵“春夏养阳，秋冬养阴”的经旨，结合临床经验研制出补肺益寿合剂。临床用其治疗慢性支气管炎、肺气肿、支气管及过敏性哮喘反复发作的肺系疾病具有显著疗效。本实验意在通过建立动物模型探讨补肺益寿合剂Ⅱ补阴润肺的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

小鼠40 只，雌雄不拘，体质量(20 ±2)g，由上海中医药大学动物实验中心提供，合格证号:SYXK(沪)2004－2005。

1.2 药物、试剂与仪器

补肺益寿合剂Ⅱ号由五味子、山药、女贞子、丹皮、太子参等药物组成，方由甘肃省中医院王自立教授提供，由甘肃中医院药剂科制备，批号:甘卫普制准字(94)188－ 04。TRIzol Reagent，加拿大Life Technologies 公司产品，批号16696－026;M－MuLV Reverse Transcriptase，美国MBI 公司产品，批号MTT－1004;Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase)，华美生物工程公司，批号MR0962;dNTP，生工生物工程公司产品，批号R0182;3－(N－吗啉代)－丙磺酸(MOPS)，美国Amresco 公司产品，批号0670;焦碳酸二乙酯(DEPC)，美国Amresco 公司产品，批号Q0640;核糖核酸酶抑制剂(RNasin)，华美生物工程公司产品，批号MN0041;Agrose，Spanish分装;100 bp DNA ladder，华美生物工程公司产品，批号A8200。引物设计按文献［1］，由上海生物工程公司合成，引物序列及扩增片段见表1。

表1 引物序列及扩增片段

PCR 仪(GeneAmp PCRSystem 9600)，美国Perkin elmer 公司产品;PB－20 pH 酸度计，美国Sartorius 公司产品;SYDR－1990 凝胶成像仪，美国Gene公司产品;Image Master VDS，美国Pharmacia 公司产品;电动高速匀浆机，美国IKA Works 公司产品;Du7500 紫外分光光度计，德国Beckman 公司产品;核酸电泳槽，上海曹行无线电元件厂产品。

1.3 模型的建立

根据文献［2］并加以修改建立肺阴虚证动物模型。将小鼠随机分为即正常对照组、模型对照组、中药补肺益寿合剂Ⅱ号(以下简称中药)小剂量组及大剂量组4 组，每组10 只。给模型对照组、中药小剂量组、中药大剂量组小鼠灌服15 g/L(每天0.01 mL/g 体质量)剂量的甲状腺素粉及0.1 g/L(每天0.01 mL/g 体质量)剂量的利血平，用药7 d;然后采用SO2熏法，于玻璃熏箱中，SO2浓度为0.09 mg/cm3，每次15 min，1 d 1 次，连熏15 d。正常对照组不做任何处理。同时中药小剂量组、大剂量组分别每天灌胃中药0.04 mL/g ，中药含量分别为22.5 g/(kg·d)、45 g/(kg·d)，1 d 1 次;正常对照组、模型对照组每天灌胃等量生理盐水。造模结束后，动物断头处死，立即取出并在冰浴上分离肺组织。

1.4 检测指标

1.4.1 组织总RN A 提取(Trizol 一步法)

①将肺组织置于10 mL 消毒试管中，每50～100 mg 组织加入1 mL Trizol 试剂，冰浴中用电动高速匀浆器制备匀浆。②每1 毫升Trizol 试剂加入0.2 mL 氯 仿，快 速 震 荡15 s，冰 浴5 min，4 ℃12 000 g 离心15 min，吸取上层水相转移到另一干净离心管内。③加入与水相等体积预冷的异丙醇，缓慢混匀，冰浴15 min，4 ℃12 000 g 离心10 min，弃上清，将离心管倒置在消毒滤纸上，吸干异丙醇。④加入75%乙醇，重悬沉淀，4℃7 500 g 离心8 min，弃上清，在消毒滤纸上吸干乙醇。⑤重复步骤④，倾去乙醇，空气干燥。⑥干燥后将沉淀溶于DEPC 水，置－70 ℃贮存，沉淀加乙醇于－20 ℃可长期贮存。⑦取4 μL 总RNA 溶液稀释至1 mL，Beckman DU 7 500紫外分光光度计检测OD 260 和OD 280 值，测定其浓度和纯度。

1.4.2组织总RNA 甲醛凝胶变性电泳

①配制1%琼脂糖甲醛变性胶:室温放置30～45 min。②预电泳:凝固的甲醛琼脂糖凝胶板放于电泳槽中，加入1×MOPS 电泳缓冲液，直到略微盖过胶面。3～4 V/cm 电压，预电泳10 min。③加样及电泳:4.5 μL RNA(总RNA 30 μg)，10 μL 去离子甲酰胺，3.5 μL 甲醛，1.0 μL 10 ×MOPS 缓冲液，95 ℃变性15 min，冰浴冷却，加2 μL 上样缓冲液混合。④3～4 V/cm 电压电泳，直至溴酚蓝迁移至胶长2/3处，停止电泳。⑤紫外灯下观察电泳结果，照相。

1.4.3 逆转录－聚合酶链式反应(RT-PCR)

(1)逆转录合成cDNA 第一链:在0.2 mL 无RNase 的PCR 管中依次加入以下试剂:Total RNA(1 g/L)3 μL，Antisense primer (25 pmol/μL)1 μL，DEPC H20(Rnase－free)调体积至12.5 μL，70 ℃变性5 min，冰浴5 min，5 × RT buffer 4 μL，10 mM 4 dNTP Mix 2 μL，RNAsin(20 U/μL)0.5 μL，M-MuLV逆转录酶(200 U/μL)1 μL，42 ℃水浴45 min，72 ℃水浴10 min。

(2)PCR 扩增:在0.2 mL PCR 管中依次加入以下试剂:逆转录产物10 μL，10 ×buffer 5 μL，MgCl2(25 mM)1 μL，DNTPs (2.5 mM)2 μL，Sense/Antisense primer 1 μL (each)，Taq DNA 聚 合 酶(5 U/μL)1 μL，DEPC H20 29 μL，瞬时离心，94 ℃预变性5 min;94 ℃1 min，94 ℃1 min，72 ℃1.5 min(IL-1循环参数);56 ℃1 min，62 ℃2 min，56 ℃2 min(TNF-α 循环参数);均为30 个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存备用。将PCR 产物进行测序，由上海生工生物工程公司协助完成，测序采用T7 和M13 通用引物。

1.5 序列的同源性分析

根据生工生物工程公司返回的测序结果，通过国际互连网进行同源性分析。以美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的BLAST(basic local alignment search tool)作为主要的检索工具，网址为:http://www.ncbi.nlm.nih.gov。进行序列比对分析的数据库主要有:①NCBI 的nr 库，包括GenBank、EMBL(Euoropean Molecular Biological Laboratory)、DDBJ(DNA Database of Japan)所收录的所有非冗余(non-redundant)序列;②NCBI 的ESTs(expressed sequence taqs)库。检索程序主要采用BLAST。以GAPDH 作为内参照，比较条带的光密度值。PCR 产物经胶回收后，进行序列测定。将序列测定结果进行同源性比对分析，与大鼠IL-1 和TNF-α cDNA 同源性100%。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 肺组织总RNA 提取结果

各组动物肺组织总RNA 提取结果均在1.8～2.0 之间，且可见18 S 和28 S 两条连续区带，28 S的亮度约是18 S 的两倍。表明RNA 完整无降解。见图1。

图1 RNA 甲醛凝胶变性电泳图

2.2 补肺益寿合剂Ⅱ号对大鼠肺组织IL-1 mRNA、TNF-α mRNA 表达的影响

与正常对照组对比，模型对照组大鼠肺组织IL-1 mRNA表达升高，差别有统计学意义(P＜0.01)。与模型对照组对比，中药大、小剂量组IL-1 mRNA表达降低，差别有统计学意义(P＜0. 05，或P＜0.01)。中药大、小剂量组IL-1 mRNA 表达对比，差别有统计学意义(P＜0.05)。见表2、图2。

表2 补肺益寿合剂Ⅱ号对大鼠肺组织IL-1 mRNA、TNF-α mRNA 表达的影响 ±s

表2 补肺益寿合剂Ⅱ号对大鼠肺组织IL-1 mRNA、TNF-α mRNA 表达的影响 ±s

注:与正常对照组对比，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01;与模型对照组对比，# P＜0.05，## P＜0.01;与中药小剂量组对比，△P＜0.05。

组别 IL-1 mRNA TNF-α mRNA正常对照组0.21 ±0.02 0.25 ±0.03模型对照组 0.44 ±0.03＊＊ 0.55 ±0.03*中药小剂量组 0.34 ±0.03* # 0.54 ±0.03*中药大剂量组 0.23 ±0.02* ##△ 0.27 ±0.06* #△

图2 中药对大鼠肺组织IL-1 表达的凝胶电泳图

与正常对照组对比，模型对照组TNF-α mRNA表达升高，差别有统计学意义(P＜0.05)。中药大剂量组与模型对照组对比，差别有统计学意义(P＜0.05)。中药大、小剂量组间比较，差别亦有统计学意义(P＜0.05)。见表2、图3。

图3 中药对大鼠肺组织TNF-α mRNA 表达的凝胶电泳图

3 讨 论

研究表明，在细胞因子网络中，IL-1、TNF-α 等与结核病、自身免疫性疾病、革兰氏阴性细菌感染、炎症等的发生发展有密切关系［3－4］。孙氏的初步研究认为，IL-1 和TNF-α 等细胞因子产生增多是肺阴虚证的本质［5］。当机体在致病因素的作用下，IL-1、TNF-α 等细胞因子的基因表达增强、细胞因子产生增多、生物学活性升高，引起细胞因子网络自稳态失衡，并使神经－内分泌系统也发生相应的继发性改变。本研究结果表明，模型对照组IL-1 mRNA 和TNF-α mRNA 表达较正常对照组明显升高(P＜0.05或P＜0.01)，中药小剂量和大剂量可使其表达下调，尤以大剂量组更为显著(P＜0. 05)。表明中药补肺益寿合剂Ⅱ号可以改善肺阴虚证时的IL-1 mRNA、TNF-α mRNA 的高表达，恢复失衡的细胞因子网络至正常状态而发挥其补阴润肺的作用，其确切机制有待进一步探讨。

［1］Ferraris N，Perroteau I，Marchis S，et al.Glutamatergic deafferentation of olfactory bulb modulates the expression of mGluRla mRNA［J］.Neuroreport，1997，8(8):1 949－1 953.

［2］邹移海，黄韧，连至诚，等. 中医实验动物学［M］. 广州:暨南大学出版社，1999:160.

［3］Dinacello CA.Biological basis of Interleukin-1 in disease［J］.Blood，1996，87(6):2 095.

［4］Feldmann M，Brennan FM，Williams RO，et a1.Cytokine expression and netwoks in rheumatoid arthritis rationale for anti-TNF-α antibody therapy and its mechanism of action［J］.Journal of Inflammation，1996，47:90.

［5］申维玺，孙燕，张叔人，等.白细胞介素－1 等细胞因子与肺阴虚证本质的相关性研究［J］. 中医杂志，2000，41(7):423.