穴位埋线对哮喘豚鼠炎性细胞因子蛋白表达影响的研究*

张贵锋，江世平，王 立，唐少兰，梁伟斌

(广东省新兴中药学校，广东 新兴527400)

哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T 淋巴细胞等多种炎性细胞参与的气道慢性炎症反应［1］。临床观察发现糖皮质激素、穴位埋线等疗法对其均有较好疗效，但是哮喘的发病和疗效机制十分复杂，诸多因素参与其中，其发生机制、疗效机制等迄今仍未完全明了。本研究运用西药地塞米松、中医穴位埋线两种疗法干预卵白蛋白致敏的哮喘豚鼠模型，观察豚鼠气管组织中相关细胞因子蛋白表达情况，探索哮喘的发病机制，西药和穴位埋线治疗哮喘的疗效机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

健康FMMU 白化豚鼠48 只，普通级，雌雄各半，体质量300～400 g，由南方医科大学实验动物研究中心提供，动物质量合格证号:0029336。实验在广州中医药大学动物实验中心进行，动物实验设施使用证明编号:0023200。

1.2 主要试剂与仪器

卵白蛋白(OVA，GradeⅡ)，美国Sigma 公司产品;“4－0”号医用羊肠线，山东圣美医疗用品有限公司产品，批号2008100911;水溶性封片剂，广州晶美公司产品，批号20080613;ET-1 羊抗兔、TGF-β1羊抗兔、MMP-9 羊抗兔、NF-κB 兔抗鼠、ICAM-1 兔抗人免疫组化试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司提供，批号BA0421－25。WH－2000 型超声雾化喷雾器，粤华医疗器械厂有限公司产品;Sartorius 电子天平BS110S，德国赛多利斯(sartorius)公司产品;Leica DMRA 显微镜、DC 200 扫描仪、Leica Qwin 550图像分析系统、光学显微镜(Olympus BX50 生物组织显微镜)、Leica 2245 型半自动石蜡切片机、Leica EG1140 型石蜡包埋机、Leica TP1020 型生物组织脱水机、Leica RM2255 型全自动石蜡切片机及Leica 5010 型石蜡切片染色机，均为德国徕卡(Leica)仪器有限公司产品;700 型恒温水浴箱，东西仪(北京)科技有限公司产品;摊烘片机，ZMN 200 型，常州市郝思琳医用仪器有限公司产品。

1.3 动物分组

将豚鼠48 只随机分为正常对照组、模型对照组、地塞米松组及穴位埋线组，每组12 只。每组雌雄各半，雌雄分笼饲养。

1.4 模型的建立

参照文献［2］建立哮喘模型。除正常对照组外，其余各组豚鼠于实验第1 天和第8 天分别腹腔注射10%卵白蛋白(OVA)和氢氧化铝溶液1 mL 致敏;实验第15 天起开始雾化吸入1% OVA 溶液20 min 诱喘，雾化流量为3 mL/min，1d 1 次，连续2 周，至豚鼠出现烦躁、呛咳、呼吸深快、点头运动及喘息等哮喘症状。正常对照组用注射用水代替卵白蛋白液进行注射和雾化吸入。

1.5 给药方法

正常对照组:不做任何干预。模型对照组:实验第15 天起腹腔注射注射用水0.020 mg/g，1 d 1 次，连续2 周。地塞米松组:于实验第15 天起腹腔注射地塞米松0.001 5 mg/g，1 d 1 次，连续2 周。穴位埋线组:哮喘症状出现后第2 天埋线，每周1 次。参照文献［3］选择豚鼠定喘穴、肺俞穴、足三里穴及丰隆穴。具体操作方法:先将羊肠线置于无菌弯盘中，倒入生理盐水冲洗，并剪成0.2～0.4 cm 小段若干;将肠线从无菌8 号注射针针尖穿入，再将预先剪去针尖的毫针从注射针针尾部穿入，羊肠线穿入注射针后保持水平，以免滑落。埋线时无菌操作，持针刺入穴位，到达预定深度后，先稍稍退针，然后一手固定注射针头，令一手拇指抵住毫针针尾作注射状，缓慢将羊肠线挤入穴内，感觉注射针内有突然空虚感时即可出针，并确认肠线已埋入皮下或肌层，无菌棉签按压针孔处止血。每穴1 针。

1.6 检测指标

1.6.1 取 材

在末次激发后2～4 h 处死豚鼠，迅速打开胸腔，暴露肺及心脏，常规取右中下肺一个横切面，包括肺门。所取组织经100 mL/L 多聚甲醛固定，常规石蜡包埋和切片(厚4 μm)待测。切片分为5 组备用。

1.6.2 内皮素－1(ET-1)的检测

采用免疫组化法检测。主要步骤按照试剂盒说明书依次进行操作:①备用切片经纯二甲苯脱腊两次，每次6 min;②梯度乙醇脱二甲苯各2 min;③自来水漂洗、PBS 漂洗各3 次，每次2 min;④加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，室温下作用10 min;⑤切片放入己沸腾的柠檬酸修复液中，继续加热至溶液冒小气泡但不沸腾为度，保持10 min;⑥停止加热，冷却至室温约25 min，流水冲洗，PBS 液洗两次，擦干切片组织周围表面水分划隔离圈，加入5%BSA封闭液，室温下作用20 min;⑦吸去血清，不洗直接滴加入相应的浓度1 ∶100 稀释后第一抗体兔抗(ET-1)100 μL/片，每组均取1 张切片滴加PBS 做阴性对照，37 ℃恒温箱内1 h;⑧PBS 冲洗，3 min ×3 次，滴加ET-1 羊抗兔生物素化二抗，37 ℃恒温箱内20 min;⑨PBS 冲洗，3 min ×3 次，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素，37 ℃恒温箱内20 min;⑩PBS洗后滴加入DAB 显色液，显色3～5 min;○1 苏木素浅复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片、分析结果。

1.6.3 转化生长因子－β1 (TGF-β1)的检测

采用免疫组化法检测。主要步骤同ET-1 检测，按照试剂盒说明书依次进行操作，不同的是选用TGF-β1 羊抗兔免疫组化试剂盒。

1.6.4 基质金属蛋白酶－9 (MMP-9)的检测

采用免疫组化法检测。主要步骤同ET-1 检测，按照试剂盒说明书依次进行操作，不同的是选用MMP-9 羊抗兔免疫组化试剂盒。

1.6.5 核转录因子(NF-κB)的检测

采用免疫组化法检测。主要步骤同ET-1 检测，按照试剂盒说明书依次进行操作，不同的是选用NF-κB 兔抗鼠免疫组化试剂盒。

1.6.6 细胞间黏附分子－1(ICAM-1)的检测

采用免疫组化法检测。主要步骤同ET-1 检测，按照试剂盒说明书依次进行操作，不同的是选用ICAM-1 兔抗人免疫组化试剂盒。

1.6.7 各指标检测结果处理

免疫组织化学染色结果采用染色指数计数法判断［4］。每张切片在10 ×20 倍光镜下随机观察每1 组动物同一部位切片，选择5 个不重复视野进行观察，并联接图像分析系统，分别测出每张切片内支气管肺组织相关细胞因子的染色百分比，即染色面积。阳性物质在胞浆(膜上)内呈棕黄色细颗粒状，细胞核为浅蓝色，阴性对照为阴性。染色强度按阳性细胞染色强弱分为无色、淡黄、黄色、棕黄色，分别计为0，1，2，3 分。染色指数=染色面积×染色强度。如在同一病变中存在不同评分标准的视野，则取最大值和最小值的平均值作为其染色指数评分。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计分析软件处理。计量资料以均数()±标准差(s)表示，两组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法。以P＜0.05 为差别有统计学意义。

2 结 果

模型对照组支气管肺组织ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 蛋白表达阳性细胞指数均显著高于正常对照组，差别有统计学意义(P＜0.01);穴位埋线组和地塞米松组支气管肺组织ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 蛋白表达阳性细胞指数均低于模型对照组，差别有统计学意义(P＜0.01);穴位埋线组支气管肺组织ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 蛋白表达阳性细胞指数与地塞米松组对比，差别无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组豚鼠支气管肺组织中蛋白表达阳性细胞染色指数比较 ±s

表1 各组豚鼠支气管肺组织中蛋白表达阳性细胞染色指数比较 ±s

注:与正常对照组对比，＊＊＊ P＜0.01;与模型对照组对比，## P＜0.05;与地塞米松组对比，△P ＞0.05。

MMP-9 NF-kB ICAM-1正常对照组 12 13.84 ±3.67 15.12 ±3.26 11.71 ±2.98 13.12 ±3组 别 动物数 ET-1 TGF-β1.03 12.10 ±2.91模型对照组 12 32.11 ±5.01＊＊＊ 35.08 ±5.19＊＊＊ 28.64 ±4.76＊＊＊ 28.14 ±4.72＊＊＊ 27.22 ±6.03＊＊＊地塞米松组 12 20.45 ±3.88＊＊＊## 23.27 ±4.02＊＊＊## 17.52 ±4.03＊＊＊## 20.10 ±4.42＊＊＊## 19.67 ±4.50＊＊＊##穴位埋线组 12 23.34 ±4.25＊＊＊##△ 25.19 ±4.13＊＊＊##△ 20.04 ±3.85＊＊＊##△ 21.33 ±3.97＊＊＊##△ 21.17 ±4.28＊＊＊##△

3 讨 论

ET-1 是迄今所知最强的气管、支气管平滑肌收缩剂，其收缩效应与浓度呈剂量依赖关系［5］。目前普遍认为ET-1 会与多种哮喘相关炎性介质相互作用而加重机体的缺血、缺氧状态，从而加重哮喘症状，增加肺循环阻力，影响哮喘患者小气道功能［6］。TGF-β1 刺激气道平滑肌细胞、成纤维细胞、杯状细胞增生肥大，促进胶原Ⅰ、Ⅳ型和纤连蛋白合成。在哮喘患者的气道中，平滑肌细胞分泌大量的TGF-β1，而TGF-β1 反过来又促进平滑肌细胞和杯状细胞增生肥大，增加胶原和纤连蛋白合成，并促进其在细胞外基质沉积，导致管腔狭窄和不可逆的肺功能改变［7－9］。MMP-9 通过降解上皮基膜及内皮的IV 型胶原而破坏上皮基膜及内皮，从而使炎症细胞穿透破裂的内皮层到达炎症部位，促进炎症的进一步发展，通过参与炎症细胞的跨膜迁移在气道炎症及气道重塑中发挥重要作用［10－12］。NF-κB 是参与炎症反应中的一个重要信号转导因子，调节许多炎症基因的表达，在诱导肺的炎症反应中起关键作用［13］。ICAM-1 参与并介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的相互黏附，是炎症形成的基础［14］。研究表明，ICAM-1 对于哮喘气道嗜酸粒细胞气道的浸润以及气道高反应性的形成具有重要作用［15］。

本研究结果表明，模型对照组、地塞米松组、穴位埋线组豚鼠气管组织中ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 阳性细胞指数均显著高于正常对照组，提示上述细胞因子与哮喘气道炎症和气道重构有内在联系，支气管肺组织ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 水平的升高可能是哮喘气道重构发生的病理机制之一。

地塞米松等糖皮质激素类药物是目前临床治疗中最为有效的药物，是治疗急性严重哮喘、慢性哮喘的首选药物。目前主要应用吸入型糖皮质激素，其起效快，局部浓度高，效果好，能改善不同程度的气流阻塞、气道高反应性以及因哮喘反复发作而减退的肺功能。本研究结果发现地塞米松组豚鼠豚鼠气管组织中ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 阳性细胞指数低于模型对照组，提示临床应用糖皮质激素类药物治疗哮喘的效果可能通过调控ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 等细胞因子的表达而发挥作用。穴位埋线组豚鼠气管组织中的ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 阳性细胞指数低于模型对照组，与地塞米松组对比，差别无统计学意义。研究结果提示，穴位埋线对于哮喘的干预效果和地塞米松无差别，这在一定程度上证明了临床运用穴位埋线治疗哮喘病的科学性，穴位埋线可能是通过调控ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 等细胞因子的表达而发挥治疗哮喘的疗效。此外，穴位埋线疗法不良反应很少，是一种公认的绿色疗法。因此，在哮喘等疾病的治疗上，传统的中医药及针灸疗法有一定的优势。

综上所述，卵蛋白致敏哮喘豚鼠气管组织中的ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 等细胞因子存在失衡，穴位埋线疗法治疗哮喘可能是通过对上述细胞因子的调控而发挥效应。本研究中埋线组和地塞米松组豚鼠气管组织中相关细胞因子的改变对比，差别无统计学意义，可能与样本量偏少有关。ET-1、TGF-β1、MMP-9、NF-kB、ICAM-1 等细胞因子在哮喘病中的作用机制有待进一步研究。

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