HPLC 法测定冬凌草中冬凌草甲素的含量

刘亚楠，雷留成，宋汉敏，王海波

(河南省食品药品检验所，河南 郑州450003)

冬凌草为唇形科植物碎米桠Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara 的干燥地上部分，别名冰凌草、碎米桠。冬凌草具有清热解毒、活血止痛之功效，用于咽喉肿痛、扁桃体炎、蛇虫咬伤，亦可用于肿瘤的辅助治疗。冬凌草主产于太行山区的河南省及山西省、河北省，济源冬凌草为国家地理标志产品;四川、贵州、广西、陕西、甘肃、江西、湖南等省亦产。文献报道，冬凌草主要有效成分为含贝壳杉烷类二萜化合物，还有部分三萜类、黄酮类、生物碱类、挥发油类成分等［1］，有效成分主要为二萜化合物，如冬凌草甲素、乙素等［2－3］。本实验建立了冬凌草中冬凌草甲素的RP-HPLC 法测定方法，为冬凌草的进一步利用和开发提供了依据。

1 仪器与试药

Waters 2690 型高效液相色谱仪、Waters 996 型二极管阵列检测器及Empower 数据处理软件，均为美国Waters 公司产品;KQ－300 型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司产品;XR205SM－DR 型十万分之一电子天平，瑞士Precisa 公司产品。18 个不同来源的药材(包括采集品和商品)经雷留成副主任药师鉴定为冬凌草Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara 的地上部分;冬凌草甲素对照品，供含量测定用，由中国药品生物制品检定所提供，批号111721－200501;甲醇(HPLC grade)，Merck 公司产品;水为市售乐百氏纯水，并经0.45 μm 水系滤膜过滤。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱Agilent ZORBAX SB－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相甲醇—水(52∶48)，检测波长239 nm，柱温35 ℃，流速1 mL/min，见图1。

图1 冬凌草甲素HPLC 色谱图

2.2 对照品溶液的制备

精密称取干燥至恒重的冬凌草甲素对照品适量，加甲醇制成每1 毫升中含62 μg 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末(过4 号筛)约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，放置30 min，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液(62 mg/L)分别进样2，7，10，15，20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，冬凌草甲素进样量在124～1 240 ng 范围内呈良好线性关系，计算回归方程为:Y=1.332 37X－1.947 09(r=0.999 997)。

2.5 精密度试验

精密吸取62.0 mg/L 的供试品溶液10 μL，重复进样6 次，测定峰面积并计算平均值，RSD 为0.54% 。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别在0，2，4，6，8 h 进样，测定峰面积并计算平均值，RSD 为1.7%。

2.7 重复性试验

精密称取同批药材6 份，按供试品溶液制备，进样10 μL，测定含量并计算平均值，RSD 为2.5%。

2.8 回收率试验

精密称取已知含量的冬凌草样品粉末6 份，每份0. 5 g，分别加入冬凌草甲素对照品溶液(0.027 20 g/L)50 mL，按供试品溶液制备，进样10 μL，测定含量。结果见表1。

表1 冬凌草甲素加样回收试验

2.9 含量测定

分别取不同来源的18 批药材1.0 g，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法，进样10 μL，分别进行含量测定，冬凌草甲素(C20H28O6)的含量按干燥品计算，结果见表2。

表2 18 批冬凌草药材中冬凌草甲素含量测定

3 小 结

有关提取方法的选择，笔者分别采用甲醇加热回流2 h、甲醇超声提取40 min、乙醚索氏提取5 h、石油醚索氏提取除杂后丙酮超声处理40 min、乙醚冷浸过夜5 种方式提取同批样品，然后用HPLC 法测定冬凌草甲素含量，结果表明甲醇超声提取的方法效果最好。有关提取时间的选择，笔者以甲醇为溶剂，以同样的溶剂量分别超声提取20，30，40 min来测定同批样品，结果冬凌草甲素含量较为接近，故以提取30 min 最为适宜。有关提取溶剂用量的选择，笔者以甲醇为溶剂，超声提取同批样品30 min，溶剂用量分别为25，50，100 mL，结果以50 mL 甲醇洗脱能较完全地提取出冬凌草甲素且节省溶剂。

综上所述，本研究所建立的冬凌草甲素含量测定方法简单、准确、重复性好，为冬凌草药材的质量控制提供了试验依据。