响应面法优化黄孢原毛平革菌产多糖培养基的研究

许艳艳，张朝晖

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

响应面法优化黄孢原毛平革菌产多糖培养基的研究

许艳艳，张朝晖*

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

将Plackett-Burman设计法和响应面分析法相结合，对影响黄孢原毛平革菌（Phanerchaete chrysoprium）生产多糖的发酵培养基进行优化。结果表明，培养温度、酒石酸铵浓度和初始pH与多糖产量存在显著的相关性，采用优化后的条件进行摇瓶发酵，得到黄孢原毛平革菌产多糖的最佳工艺条件：葡萄糖10g/L，酒石酸铵0.4g/L，大量溶液60mL/L，微量元素液25mL/L，维生素B11mg/L，初始pH4.5，发酵温度37℃，接种量10%，非固定化培养5d。多糖产量从289.3mg/L提高到467.9mg/L。

黄孢原毛平革菌，多糖，响应面，优化

黄孢原毛平革菌（Phanerchaete chrysoprium）是白腐真菌的一种，具有发达的菌丝体。孢子表面有小杆状结构，表面组成为蛋白质35%，糖20%，类烃物质33%。采用发酵法生产真菌提取多糖具有周期短、成本低、产量大、易于大规模生产的优点，是一种大量获得真菌多糖的有效途径，对真菌多糖在生命科学、医药科学的研究与开发有重要意义［1］。本研究试图从黄孢原毛平革菌中提取胞外多糖，进行多糖的组成性质的研究，扩展人们对微生物来源的多糖的认识。响应面分析（Response Surface Methodology）法系采用多元二次回归方法作为函数估计的工具，将多因子实验中因素与指标的相互关系用多项式近似拟合，依此可对函数的响应面和等高线进行分析，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互关系。它与过去广为使用的“正交实验设计法”不同，具有实验周期短，求得的回归方程精度高，能研究几种因素间交互作用等优点［2］。本研究在单因素实验的基础上，利用响应面分析法对黄孢原毛平革菌多糖发酵培养基进行了优化。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌种 黄 孢 原 毛 平 革 菌（Phanerchaete chrysoprium）ATCC24725；麦芽汁斜面培养基 葡萄糖8g/L，麦芽汁10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，天冬氨酸1g/L，KH2PO42g/L，MgSO41g/L，维生素B11mg/L，琼脂20g/L，NaOH调pH≥6.0；初始发酵培养基 葡萄糖 10g/L，NH4Cl 0.2g/L，大量元素液［3］60mL/L，微量元素液［3］25mL/L，维生素B11mg/L；优化后发酵培养基 葡萄糖10g/L，酒石酸铵0.4g/L，大量元素液60mL/L，微量元素液25mL/L，维生素B11mg/L。

1.2 实验方法

1.2.1 孢子的制备 将孢子接种在上述固体培养基斜面上，30℃下培养5d，用无菌水把孢子洗出，4层纱布过滤。孢子浓度可由650nm下的吸光度来测定（当吸光度为1.0时，孢子浓度大约是5×106个/mL）。

表1 Plackett-Burman实验设计及响应值

表2 Plackett-Burman实验设计的因素水平及效应分析

1.2.2 培养方法 取发酵培养基100mL加入500mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，孢子接种（每瓶接种量约3×107），置于37℃摇床培养，转速140r/min。

1.2.3 多糖提取 将发酵所得的发酵液在热水浴中浸提一段时间，期间不停进行搅拌，使胞外糖析出，冷却后过滤，收集发酵液备用，采用旋转蒸发仪进行真空浓缩，加入3倍体积的体积分数95%乙醇沉淀，尽量提高得率。选用真空冷冻干燥得到多糖。

1.2.4 分析方法 3，5-二硝基水杨酸法测还原糖［4］，苯酚-硫酸法测总糖［5］。

1.3 实验设计

1.3.1 Plackett-Burman设计［6-7］Plackett-Burman（PB）法是一种近饱和的2水平实验设计方法。它基于非完全平衡块原理，能用最少实验次数估计出因素的主效应，以从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究。

影响黄孢原毛平革菌多糖发酵的可能因素包括碳源、氮源浓度，pH、发酵温度、培养转速、培养时间、接种量、菌体形态等。为对这8个因素进行全面考察，选用了N=11的PB设计，并余留3个空项作误差分析［8］。每个因素取2个水平：低水平和高水平分别用“-”和“+”符号表示。实验设计如表1所示，各参数所代表因素及其水平见表2。

1.3.2 Box-Behnken中心组合设计［9-11］响应面分析法（response surface analysis）是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法，其中最常用的是Box-Behnken的中心组合设计原理，本研究采用Box-Behnken中心组合设计对Plackett-Burman实验筛选到的关键因子进一步研究，以获得影响黄孢原毛平革菌发酵产多糖的优化培养基。自变量按下式进行编码变换：

式中，Xi为自变量xi的编码值，x0为自变量xi在中心点的值，△xi为自变量变化步长。用标准多项式回归方程，对实验数据进行拟合，便得到一个二次多项式，该方程为描述相应量（应变量）自变量关系的经验模型。模型可描述为：

式中，Y为预测响应值，β0为截距，βi为线性系数，βii为平方系数，βij为交互作用系数。用 Design Expert程序对实验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检验及方差分析。所得拟合方程式（2）分别对各自变量求偏导数，得到方程

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman设计对显著因子的筛选

根据单因素实验，选用实验次数N=12的实验设计，对葡萄糖（A），酒石酸铵（B），培养转速（D），培养时间（E），初始pH（G），培养温度（H），接种量（J），菌体形态（K）8个因素进行考察，每个因素选高低2个水平，以多糖的产量作为响应值（Y）。另设3个虚拟列（C，F，I），以考察实验误差。对实验结果进行分析得出各因素的t值和可信度水平。实验设计及结果如表1所示（每组实验有3个重复，以平均值为准），分别计算各因素效应并进行重要性评价，结果见表2。

由表2的分析结果可知，在黄孢原毛平革菌产多糖过程中，培养温度、酒石酸铵和初始pH三个因素对多糖产量影响显著，可信度在90%以上，可考虑作为主要因素进一步做响应面实验。而其他因素的取值则根据各因素效应的正负和大小，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值。

2.2 响应面分析实验优化设计培养基

2.2.1 Box-Behnken实验设计 根据 Plackett-Burman实验确定的实验因素和水平，采用 Box-Behnken实验设计对产多糖发酵培养基进行三因素三水平的响应面分析实验，以培养温度X1（℃），酒石酸铵浓度X2（g/L）和初始pH X3为自变量，响应值Y为多糖产量。实验设计及结果见表3。

表3 三因素三水平的Box-Behnken实验设计及相应结果

2.2.2 二次回归拟合及方差分析 利用统计软件MINITAB14.11对实验数据进行二次多项回归拟合。多项式模型方程拟合的性质由确定系数R2表达，其统计学上的显著性由T检验确定。通过RSREG（响应面回归）过程进行数据分析，建立二次响应面回归模型，并进而寻求最优相应因子水平，所得的分析结果见表4。

表4 Box-Behnken实验设计回归分析结果

图1～图3为响应面分析的立体图，从图中可直观地看出各因子对响应值的影响变化趋势，而且回归模型确实存在最大值。求解方程组可以得出模型的极值点：X1=0.713，X2=-0.226，X3=0.174。相当于培养温度38.565℃，酒石酸铵0.4322g/L，初始pH 4.4631。

图1 Y=f（X1，X2）响应面

图2 Y=f（X1，X3）响应面

图3 Y=f（X2，X3）响应面

为了检验模型预测的准确性，在最佳发酵条件和原始发酵条件分别进行发酵实验，所得实际产多糖量分别为467.9mg/L和289.3mg/L，可见该模型能较好地预测实际发酵情况。

3 结论

实验证明，Plackett-Burman设计与响应面方法（RSM）相结合的实验统计方法能快速、有效地从众多影响黄孢原毛平革菌多糖产量液体发酵的因素中筛选出比较重要的影响因素并实现条件优化，得到最佳操作条件，优化结果与实际发酵情况吻合较好。

经上述方法优化，黄孢原毛平革菌产多糖液体发酵的最佳培养基为：葡萄糖10g/L，酒石酸铵0.4g/L，大量溶液60mL/L；微量元素液25mL/L；维生素B11mg/L；最佳发酵条件为pH4.5，发酵温度37℃，接种量10%，非固定化培养5d。在此条件下，多糖产量从289.3mg/L提高到467.9mg/L。

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Optimization of fermentation conditions for polysaccharides of Phanerchaete chrysoprium based on response surface analysis

XU Yan-yan，ZHANG Zhao-hui*
（Department of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Two level factorials designs of Plackett-Burman were constructed to select the Phanerchaete chrysoprium fermentation medium components of polysaccharides.Experimental results showed that culture temperature，ammonium tartrate concentration and initial pH all had significant influence on the polysaccharides production，and the optimal conditions were as follows：glucose 10g/L，ammonium tartrate 0.4g/L，the volume of mass element solution 60mL/L，the quantity of trace element solution 25mL/L，VB11mg/L，initial pH4.5，culture temperature 37℃，inoculation quantity of 10%，nonimmobilized culture 5d.Under the optimal conditions，the polysaccharides production was increased from 289.3mg/L to 467.9mg/L.

Phanerchaete chrysoprium；polysaccharides；response surface method；optimization

TS201.2+3

A

1002-0306（2010）11-0221-04

2009-10-14 *通讯联系人

许艳艳（1982-），女，硕士研究生，研究方向：生物工程。