芡实黄酮类物质的提取及抗氧化性研究

李成良 ，陈学好 ，李良俊 ，张奉民 ，齐斌 ，钱建亚

（1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州，225009；2.扬州大学园艺与植物保护学院；3.扬州大学测试中心；4.常熟理工学院食品与生物工程学院）

芡实（Euryale feroxSalisb），睡莲科芡属，一年生大型水生草本植物，原产中国和东南亚，广泛生长于我国南方湖泊、池塘和滩地，是一种新兴的特种水生植物[1，2]。

芡实主要以种仁（通称芡米）供食用，其营养成分以淀粉为主，另含有蛋白质、维生素、钙、磷、铁、硫胺素、核黄素、尼克酸、抗坏血酸、黄酮、氨基酸和葡糖基甾醇类化合物等[3,4]。芡实不仅具有较高的营养价值，还具有养血安神、益肾固精、去湿健脾、止泻止带等药用功效。《神农本草经》将芡实列为上品，记有“主治湿痹，腰脊酸痛，补中除暴疾，益精气，强志，令耳目聪明，久服轻身不饥”。芡实味甘性平，入脾、肾、胃经，既能益肾，又能健脾，先天、后天之本皆齐备，能提高人体的免疫力，从而祛病强身，延年益寿，是平补之佳品[5,6]。对芡实保健功效和药用价值的认识由来已久，但对其起作用的成分和机理的说明鲜见报道。本文以紫花苏芡和紫花刺芡种仁为原料，研究黄酮类物质的提取条件及提取物的抗氧化性质，以期为芡实的科学利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为扬州大学水生蔬菜试验基地种植的“紫花苏芡”和“紫花刺芡”的成熟种仁。主要试剂芦丁、DPPH为Sigma公司产品。

1.2 试验方法

①水分测定 根据GB/T 12087-2008淀粉水分测定法进行。

②芡实总黄酮含量测定 采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH比色法[7～9]测定总黄酮含量。将去壳的芡实种子粉碎过孔径1 mm筛。取2 g粉，加入80 mL 95%（V/V，下同）乙醇，80℃水浴加热回流3 h，抽滤，所得滤液用95%乙醇定容至100 mL，根据标准曲线，结果以芦丁含量表示。试验重复3次，结果取平均值。

③直接加热浸提法 a.料液比对提取效果的影响。取15个锥形瓶，分成5组并标记，分别称取5.0 g芡实粉于 250 mL 锥形瓶中，加入 25，50，75，100，125 mL 95%乙醇，60℃浸泡2 h，过滤，清洗，然后用 95%乙醇定容至100 mL，测220 nm处的吸光度，根据标准曲线换算成黄酮量，除以总黄酮量得提取率。试验重复3次，结果取平均值。

b.温度对提取效果的影响。取15个锥形瓶，分成五组并标记，分别称取5.0 g芡实粉于250 mL锥形瓶中，加入50 mL 95%乙醇，分别于50℃，60℃，70℃，80℃和90℃保温2 h，过滤，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，测220 nm处的吸光度，根据标准曲线换算成黄酮量，除以总黄酮量得提取率。试验重复3次，结果取平均值。

c.浸泡时间对提取效果的影响。取15个锥形瓶，分成5组并标记，分别称取5.0 g芡实粉于250 mL锥形瓶中，加入 50 mL 95%乙醇，60℃浸泡 1，2，3，4，5 h，过滤，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，测220 nm处的吸光度，根据标准曲线换算成黄酮量，除以总黄酮量得提取率。试验重复3次，结果取平均值。

④黄酮超声波辅助浸提法 a.料液比对提取效果的影响。取15个锥形瓶，分成五组并标记，分别称取5.00 g芡实于250 mL锥形瓶中，再向其中加入5，25，50，75，100 mL 95%乙醇，用 400 W 超声波处理 10 min，过滤，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，测220 nm处的吸光度，根据标准曲线换算成黄酮量，除以总黄酮量得提取率。试验重复3次，结果取平均值。

b.超声波功率对提取效果的影响。取15个锥形瓶，分成5组并标记，分别称取5.00 g芡实于250 mL锥形瓶中，再向其中加入50 mL 95%乙醇，分别用200，300，400，500，600 W 超声波处理 10 min，过滤，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，测220 nm处的吸光度，根据标准曲线换算成黄酮量，除以总黄酮量得提取率[10～13]。试验重复3次，结果取平均值。

c.超声波处理时间对提取效果的影响。取15个锥形瓶，分成五组并标记，分别称取5.00 g芡实于250 mL锥形瓶中，再向其中加入50 mL 95%乙醇，分别在400 W 超声波处理 5，10，15，20，25 min，过滤，清洗，然后用95%乙醇定容至100 mL，测220 nm处的吸光度，根据标准曲线换算成黄酮量，除以总黄酮量得提取率。试验重复3次，结果取平均值。

⑤超声波辅助提取条件优化 根据提取时间、料液比和超声功率3个因素的单因素试验结果，采用正交试验进行提取条件优化。

⑥芡实黄酮提取液抗氧化性研究 a.清除DPPH能力的测定。对不同黄酮含量的受试物进行反应动力学测定，根据体系达到稳定时残留的DPPH百分数对黄酮（以芦丁为代表）与DPPH摩尔比作图，得到自由基的清除能力（EC50），定义为使起始DPPH浓度降低50% 所需黄酮的量，其倒数（1/EC50）为抗自由基能力（ARP）。使用 A-300 EPR 波谱仪（Bruker,德国），谐振腔为HSC（ER 4119），频率为X波段。将不同摩尔比的DPPH和提取物加入50 μL硼制毛细管，在谐振腔中用硅制吊环固定毛细管。操作温度为20℃。5 min起，每间隔5 min记录一次信号。DPPH的电子顺磁波谱图是五重峰，利用绝对值较大的第2个波峰为计算依据，以加入受试物前后波峰信号大小的比值衡量DPPH的清除能力[14,15]。

表1 超声辅助黄酮提取因素及水平

b.对羟自由基的清除作用。样品组试管中加入1 mL 2 mmol/L FeSO4、1 mL 6 mmol/L 水 杨 酸 、1.2 mL不同浓度的芡实提取溶液、1 mL 6 mmol/L H2O2或1.2 mL蒸馏水，37℃恒温水浴保温一定时间后，取出冷却，测定OD50，根据以下公式计算·OH的清除率[16,17]。

清除率（%）=1-（A1-A2）/A0

其中：A0为不含样品时的吸光值

A1为含有样品的吸光值

A2为含有样品，但不含水杨酸和H2O2的吸光值

2 结果与分析

2.1 芡实种仁中的黄酮类物质和水分含量

紫花苏芡的黄酮类物质含量为（1.864±0.029） mg/g，水分为（92.3±3.5）g/kg；紫花刺芡的黄酮类物质含量为（1.735±0.005） mg/g，水分为（77.3±1.7） g/kg。

2.2 芡实黄酮类物质的特征光谱

在200～780 nm的范围内，芡实提取液的最大吸收峰出现在219.9 nm处（图1，因可见光区无吸收，图中只标示出紫外光区部分吸收光谱），这是黄酮物质常见的光吸收特征。

2.3 芡实种仁黄酮类物质加热浸提效果

①料液比的影响 在其他条件一定的情况下，随着料液比增加，芡实中黄酮的提取率增加（图2）。在料液比为 1∶25（m/V）时，黄酮提取率最大，为 85.92%。

②提取温度的影响 在其他条件一定的情况下，随着温度增加，黄酮的提取率呈增加趋势（图3），在80℃时获得了最大提取率，提取率为82.29%。

表2 超声辅助黄酮提取正交试验设计及结果

③提取时间的影响 在其他条件一定的情况下，随着提取时间增加，黄酮提取率总体呈上升趋势（图4），在4 h时获得最大提取率83.43%。

图5 料液比对提取效果的影响

图6 时间对提取效果的影响

图7 超声功率对提取效果的影响

2.4 芡实黄酮超声波辅助浸提效果

①料液比的影响 与上述纯粹的加热提取比较，超声辅助提取时，随着料液比增加，黄酮的提取率呈现增长趋势，在料液比为1∶25（m/V）时获得最大提取率88.86%（图5）。

②提取时间的影响 很明显，超声辅助提取可大大缩短提取时间，在20 min时获得最大提取率87.87%（图6）。

③超声功率的影响 在其他条件一定的情况下，超声功率对黄酮的提取有较大影响，在500 W时获得最大提取率（85.21%）（图7）。

2.5 超声波辅助浸提法的条件优化

在以上单因素试验的基础上，选择提取时间、料液比和超声功率3个因素，根据表1的试验方案，对所得结果（表2）进行方差分析，结果（未列出）表明各因素对芡实中黄酮提取效果的影响依次为：提取时间 ＞料液比 ＞超声功率，单个因素之间没有显著差异。最佳提取工艺为：提取时间20 min，功率：400 W，料液比：1∶20（m/v）。

2.6 芡实黄酮类物质的抗氧化作用

①清除DPPH的能力 以DPPH自由基剩余率为纵坐标，时间为横坐标作图，得到紫花苏芡和紫花刺芡类黄酮清除DPPH自由基动力学（图8），结果表明芡实类黄酮属于慢反应动力学类型[18]。由图9可见，芡实清除DPPH的能力与紫花刺芡相当，其EC50都约为0.075，故其 ARP 为 13.3。

②清除羟自由基的能力以羟自由基为纵坐标，时间为横坐标作图，得到紫花苏芡和紫花刺芡类黄酮清除-OH自由基动力学（图10）。图11可以看出，紫花苏芡对羟自由基的抑制能力明显好于紫花刺芡，其半抑制浓度 IC50约为 9.4 mg/L。

3 讨论

采用这2种提取方法的黄酮提取率没有显著差异，直接提取方法过程控制简单，容易实施，但时间和溶剂的消耗较多。超声辅助提取是越来越多使用的方法，省时快捷，但是否会破坏有效成分尚不清楚，工业化生产规模会受到设备大小制约。

图8 类黄酮清除DPPH动力学

图9 芡实提取液的EC50

DPPH是一种很稳定的氮中心的自由基。通过检测某物质对DPPH自由基的清除能力可以评价其抗氧化性的强弱。羟自由基是氧化性极强的氧化剂，其化学性质非常活泼，是对机体为害最大的自由基，可损伤蛋白质、核酸、脂质等多种生物大分子，尤其对脂过氧化的作用最强，不仅是膜脂质过氧化的主要原因，而且还一直被认为是引起DNA损伤的重要因素。紫花苏芡和紫花刺芡类黄酮提取物都具有清除DPPH和羟自由基的能力，但效果有差别。从DPPH的清除效果看，芡实黄酮具有很强的抗氧化功能。体外抗氧化试验有多种体系，其结果有不同的含义，要综合评价某种物质的抗氧化性能需经多种体系验证。此外，本文得到的是混合物，进一步的工作可以对提取物进行分离，研究黄酮类化合物的组成和结构，从而弄清差别产生的原因。

[1]赵有为.中国水生蔬菜[M].北京：中国农业出版社，1999,52.

[2]刑湘臣.芡实杂谈[J].烹调知识，2001，：（7）：46-47.

[3]张名位，池建伟，孙玲，等.潮州芡实的营养学评价[J].广东农业科学，1999（2）：27-29.

[4]李美红，杨雪琼，万直剑，等.芡实的化学成分[J].中国天然药物，2007，5（1）：24-26.

[5]农训学.平补佳品芡实[J].东方药膳，2006（5）：39-40.

[6]朱聪明，朱萍.芡实古今应用谈[J].河南中医，2004，24（4）：65.

[7]闫红霞.苦丁茶叶中总黄酮的含量测定[J].石油化工应用，2006（4）：27-28.

[8]闫斐艳，杨振煌，李玉英，等.苦荞种子总黄酮提取方法的比较研究[J].食品与药品，2010，12（13）：93-95.

[9]张海悦，王黎兵，郭新力.狭叶荨麻总黄酮的测定[J].食品科技，2007（12）：181-184.

[10]赵文红，赵翾，白卫东，等.柿叶黄酮化合物提取工艺研究[J].陕西科技大学学报，2007，25（5）：54-57.

[11]赵琳，赵彩丹，赵焕君.槲树叶总黄酮提取工艺优选研究[J].亚太传统医药，2010，6（2）：28-29.

[12]张晨，杨晓泉，唐传核.加热预处理对大豆异黄酮含量及组分的影响[J].粮食加工，2005（6）：55-58.

[13]王昌禄，江慎华，陈志强，等.香椿老叶总黄酮提取工艺及其抗氧化活性的研究[J].北京林业大学学报，2008，30（4）：28-33.

[14]刘栋，钱建亚，翁利珍.甘薯水溶性紫色素清除DPPH自由基活性研究[J].食品科技，2003（12）：50-52,60.

[15]Qian J Y,Liu D,Huang A G.The efficiency of flavonoids in polar extracts ofLycium chinenseMill fruits as free radical scavenger[J].Food Chemistry,2004,87(2):283-288.

[16]Zhao F P,Strack D,Baumert A,et al.Antioxidant flavonoidsfrom leavesofPolygonumhydropiper[J].Phytochemistry,2003,62：219-228.

[17]丁利君，冼建毅.黄芪中黄酮类化合物提取及其对羟自由基清除作用[J].食品与机械，2002（3）：20-21.

[18]Brand-Williams W,Cuvellier M E,Berset C.Use of a free radical to evaluate antioxidant activity[J].Lebensm-Wiss U-Technol,1995,28：25-30.