蓝果忍冬总黄酮提取工艺研究

赵 佳，霍俊伟

（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨150030）

蓝果忍冬总黄酮提取工艺研究

赵 佳，霍俊伟*

（东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨150030）

采用乙醇提取法提取蓝果忍冬中总黄酮，并采用分光光度法，以芦丁为标准品测定蓝果忍冬果实中总黄酮的含量。通过单因素实验分析了乙醇浓度、料液比、提取温度及提取时间四个主要因素对提取液中总黄酮含量的影响。再在单因素实验的基础上通过正交实验设计优化蓝果忍冬果实总黄酮的提取条件。结果表明：蓝果忍冬果实总黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度70%，料液比1∶50，提取温度50℃，提取时间2.5h。此条件下总黄酮的含量为27.44mg/g。

蓝果忍冬，总黄酮，提取工艺

蓝果忍冬（Lonicera caerulea L.）俗称蓝靛果、黑瞎子果、山茄子、羊奶子等。在植物分类学上属于忍冬科（Caprifoliaceae）、忍冬属（Lonicera Linn.）、忍冬亚属（Subgen.Lonicera）、囊管组（Sect.isika DC.）、坛果亚组（Subsect caeruleae Rehd.）［1］。蓝果忍冬主要分布在我国吉林省长白山区、黑龙江省大、小兴安岭、东部山区以及内蒙古、华北、西北、四川等地。此外，俄罗斯远东地区、日本及朝鲜北部等地都有分布［2］。蓝果忍冬是一种野生浆果类植物，含有丰富的氨基酸、维生素和生物活性物质，营养保健价值极高，很早就被用于民间医疗，可促进血液循环、防治心血管疾病、降血压、清热解毒、抗疲劳、抗氧化，甚至具有抗肿瘤的功效，因此，在医学上具有一定价值［3-5］。除此之外，蓝果忍冬果实还适合鲜食以及加工成果汁、果酒、饮料、果酱、罐头等，也是加工天然食用色素的原料［6］。蓝果忍冬果实中所含的黄酮类化合物作为一种功能成分，具有许多有益的生理功能和药理作用，越来越引起人们的重视。目前对黄酮类成分定量及定性分析已有文献报道，但以蓝果为实验材料的研究还较少［7-9］。本实验采用分光光度法测定蓝果忍冬果实中黄酮类化合物的含量，对其最佳提取工艺进行初步研究，为蓝果忍冬药用价值、经济价值的进一步研究和开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蓝果忍冬果实 2009年5月采自东北农业大学园艺中心；芦丁（rutin）标准品、无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠 均为分析纯。

T6可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；R205旋转蒸发仪 配有W2058型数控恒温水浴锅，上海申胜生物技术有限公司；SHBⅢA循环水式多用真空泵 郑州长城工贸有限公司；BT124S电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；HWS28型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蓝果忍冬果实中总黄酮的测定

1.2.1.1 对照品溶液的制备 参照的方法［10］精密称取在120℃减压干燥至恒重的的芦丁对照品50mg，至25mL容量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热，溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10mL置100mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（含无水芦丁0.2mg/mL）。

1.2.1.2 标准曲线的绘制 精密吸取对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0与6.0mL，分别置于25mL容量瓶中，各加水至 6.0mL，加 5%亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加10%硝酸铝溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加4%氢氧化钠溶液10.0mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，在510nm波长处测定吸光度。

1.2.1.3 样品溶液的制备 准确称取1.0g蓝果忍冬果，粉碎，按一定条件提取后，将提取液抽滤，取滤液浓缩，所得滤液1mL置于25mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，摇匀备用。

1.2.1.4 样品总黄酮含量的测定 取上述样品溶液3mL，置于25mL容量瓶中，按照标准曲线绘制方法操作，以样品溶液3mL加水稀释至25mL作空白对照，测定吸光度。计算提取液中的总黄酮含量。

式中，C为总黄酮浓度（mg/mL）；N为稀释倍数；V为最初定容体积（mL）；m为样品质量（g）。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 乙醇浓度对蓝果忍冬果实总黄酮提取的影响 保持料液比、提取温度及提取时间不变，分别测定乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%时蓝果忍冬果实中总黄酮的含量。

1.2.2.2 料液比对蓝果忍冬果实总黄酮提取的影响

保持乙醇浓度、提取温度及提取时间不变，分别测定料液比为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70时蓝果忍冬果实中总黄酮的含量。

1.2.2.3 提取温度对蓝果忍冬果实总黄酮提取的影响 保持乙醇浓度、料液比及提取时间不变，分别测定提取温度为30、40、50、60、70℃时蓝果忍冬果实中总黄酮的含量。

1.2.2.4 提取时间对蓝果忍冬果实总黄酮提取的影响 保持乙醇浓度、料液比及提取温度不变，分别测定提取时间为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h时蓝果忍冬果实中总黄酮的含量。

1.2.3 正交实验 参照单因素实验结果，对乙醇浓度、料液比、提取温度以及提取时间四个提取条件进行初步筛选，通过四个因素，三个水平L9（34）正交实验分析提取条件对蓝果忍冬果实总黄酮提取的影响，优选最佳提取工艺。L9（34）因素水平见表1。

表1 L9（34）因素水平表

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

以吸光度（A）为纵坐标，芦丁浓度（C）为横坐标，制作标准曲线如图1，回归方程为：y=5.2714x+ 0.0019，R2=0.9992。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇浓度对提取结果的影响 从图2中可以看出，随乙醇浓度的增加，吸光度先增高后降低，其中乙醇浓度为70%时吸光度最大，即提取液中总黄酮含量最多，当乙醇浓度超过70%后，总黄酮含量开始降低。可能是由于随着乙醇浓度增大，黄酮类化合物达到饱和，同时一些醇溶性杂质、色素、亲酯性强的成分溶出量增加，这些成分与黄酮类化合物竞争同乙醇-水分子结合，从而导致黄酮类化合物的提取率下降［8］。故因此确定乙醇浓度在 70%左右较好。

图2 乙醇浓度对总黄酮提结果的影响

2.2.2 料液比对提取结果的影响 从图3中可以看出，最初随着料液比的增大总黄酮含量也逐渐增大，但达到一定的料液比后，总黄酮含量开始减少，其中料液比为1∶50时总黄酮含量最高。一般来说，溶剂用量越大，提取率越大，但是过多的料液比会造成溶剂和能源的浪费，同时增大溶剂量，很有可能把一些不易溶出的成分提取出来造成黄酮类化合物的提取率降低［9］。因此1∶50的料液比最合适。

图3 料液比对总黄酮提结果的影响

2.2.3 提取温度对提取结果的影响 从图4中可知，在30～50℃期间，随着温度的升高，吸光度也随之增高；在50～70℃期间，随着温度的升高吸光度反而降低。在初始阶段，随着提取温度的升高黄酮类化合物的含量升高，但是温度过高可能引起黄酮类化合物结构被氧化破坏导致其含量降低［10］。因此50℃为适宜提取温度。

图4 提取温度对总黄酮提结果的影响

2.2.4 提取时间对提取结果的影响 从图5中可知，随着提取时间的增长，总黄酮的含量呈现先增加后下降的变化规律，当提取时间为2.0h时，提取效果最好。但若时间继续延长，总黄酮含量反而降低。这可能是提取时间太长，某些黄酮类化合物分解所致。因此，选择提取时间为2.0h左右为宜。

图5 提取时间对总黄酮提取结果的影响

2.3 总黄酮提取工艺优化

表2 正交实验结果及分析

由表2正交实验结果分析可知，影响总黄酮得率的主次顺序为A＞B＞C＞D，即乙醇浓度＞料液比＞提取温度＞提取时间。乙醇提取蓝果忍冬果实中总黄酮的最佳的提取工艺为：A2B2C2D3，即选用70%乙醇，料液比为1∶50，在50℃的条件下提取2.5h。按A2B2C2D3组合进行实验，总黄酮得率为27.44mg/g。

3 结论

目前，对蓝果忍冬果实中总黄酮提取的研究报道较少，还未见探讨优化提取条件的文章，本实验首次研究乙醇浓度等因素对总黄酮提取率的影响，结果表明：

3.1 通过单因素和正交实验，确定提取蓝果忍冬果实总黄酮的最佳工艺为：选用70%乙醇，料液比为1∶50，在50℃的条件下提取2.5h。这时蓝果忍冬果实总黄酮的含量为27.44mg/g。

3.2 在影响蓝果忍冬果实中总黄酮含量的四个提取条件中，乙醇浓度影响最大，为最显著因子，其次为料液比和提取温度，提取时间影响最小。

［1］霍俊伟，杨国慧，睢薇，等.蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea）种质资源研究进展［J］.园艺学报，2005，32（1）：159-164.

［2］霍俊伟，睢薇，于泽源，等.野生蓝靛果忍冬人工驯化栽培［J］.北方园艺，2004（4）：31.

［3］Svobodova A，Rambouskova J，Walterova D，et al.Protective effects of phenolic fraction of blue ho-neysuckle fruits against UVA-induced damage to human keratinocytes［J］.Arch Dermatol Res，2008，300：225-233.

［4］Xue-Hai Jin，Ohgami K，Shiratori K，et al.Effects of blue honeysuckle（Lonicera caerulea L.）extract on lipopolysaccharideinduced inflammation in vitro and in vivo［J］.Experimental Eye Research，2006，82：860-867.

［5］李佳，李国庆，吴松林，等.黑加仑和蓝靛果对家兔高血脂作用的研究［J］.地方病通报，2009，24（1）：14-18.

［6］赵彦杰.蓝靛果紫红色素的提取及其理化性质研究［J］.食品科学，2006，27（10）：276-278.

［7］洪淳赞，金胜日，姜哲，等.蓝靛果中总黄酮含量测定方法的探讨［J］.延边大学医学学报，2000，23（1）：41-42.

［8］侯江雁，李彦冰.蓝靛果果实中总黄酮的含量测定［J］.黑龙江医药，2001，14（4）：252.

［9］颜承云，谷继伟.蓝靛果忍冬果实黄酮类成分总含量的动态分析［J］.中国野生植物资源，2004，23（2）：51-52.

［10］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典［M］.2000年版.广州：广东科技出版社，2000：173.

Study on extraction technology of total flavonoids from berry of blue honeysuckle（Lonicera caerulea L.）

ZHAO Jia，HUO Jun-wei*
（College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

Total favonoids in berry of blue honeysuckle（Lonicera caerulea L.）was extracted by ethanol，and its content was detected by spectrometric method with rutin as standard material.ln the extracting process of total flavonoids，four main factors including concentration of extracting ethanol，solid-liquid ratio，temperature and time were studied by single factor analysis method.Based on single factor test，the optimal extraction conditions of total flavonoids were determined by orthogonal test as follows：ethanol concentration 70%，solid-liquid ratio 1∶50，temperature 50℃and extracting time 2.5h.Total flavonoids yield from blue honeysuckle（Lonicera caerulea L.）was 27.44mg/g by the optimal process.

blue honeysuckle（Lonicera caerulea L.）；total flavonoids；extraction technology

TS255.1

B

1002-0306（2010）11-0242-03

2009-12-02 *通讯联系人

赵佳（1984-），女，在读硕士研究生，研究方向：小浆果生物活性物质分离、提取、鉴定。

农业部公益性行业科技专项（nyhyzx07-028）；东北农业大学创新专项项目（CXZ005-1）；黑龙江省科技攻关项目（GB06B112）；哈尔滨市科技攻关项目（2007AA6CE114）。