解脂酵母中POX3基因的敲除研究

师慧敏，王 芳，黄 琳，刘常金，*，张治洲，2，*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.哈尔滨工业大学（威海）科学与工业技术研究院，山东威海246209）

解脂酵母中POX3基因的敲除研究

师慧敏1，王 芳1，黄 琳1，刘常金1，*，张治洲1，2，*

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.哈尔滨工业大学（威海）科学与工业技术研究院，山东威海246209）

对耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）中编码与γ-癸内酯合成相关的乙酰辅酶A氧化酶基因（P0X1-P0X5）中的P0X3基因用Cre/loxP同源重组系统进行敲除。设计含有60个核苷酸与P0X3基因的ORF两侧序列同源的长引物，以pUG6为模板构建带有loxP-KanMX-loxP系统的敲除组件，之后转化耶氏酵母，通过PCR确定阳性克隆子。将质粒pSH65转入阳性克隆子，半乳糖诱导表达Cre酶以切除KanMX基因。最后在YPD培养基中传代丢失pSH65质粒，获得P0X3缺陷型菌株。由于在解脂酵母中表达生产γ-癸内酯直接牵扯到若干个需要抑制的基因，单独缺失其中的一个基因理论上可能实现不了产量的极大值。本研究为进一步构建组合敲除准备了条件。

耶氏酵母，P0X3基因，基因敲除，Cre/loxP系统，γ-癸内酯

γ-癸内酯（gamma-decalactone，GDL）是一种重要的食品香料，广泛地存在于水果、肉制品和日常食品中，它以其诱人的桃香和低香气阈值的特性而在香料工业中普遍应用［1］。耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是生物法生产 GDL的主要酵母菌［2-3］，它以C18蓖麻油酸为底物经过β-氧化使碳链缩短，再内酯化成C10的GDL。乙酰辅酶A氧化酶是β氧化过程的重要酶，耶氏酵母菌中含有由至少五个不同乙酰辅酶A氧化酶组成的酶体系（Aox 1～5）。POX1～POX5为对应的编码Aox 1～5这五个乙酰辅酶A氧化酶的一组基因［4］，其中Aox1作用不详，Aox2可促进C18蓖麻油酸经β氧化为C10的GDL过程，Aox3～Aox5则对生成其他C10的产物（包括2-癸烯、3-羟基癸内酯和3-癸烯）和γ-癸内酯的降解过程有不同程度的促进作用［2］。以PCR为基础的基因敲除方法，尤其是loxP-Marker-loxP序列组件和Cre/loxP系统的应用是一种快速、准确的基因敲除手段［5］。黄建忠研究组在酿酒酵母乙醇脱氢酶研究上使用了loxPMarker-loxP序列组件和Cre/loxP系统成功敲除了ADH3、ADH2和SFA1双倍体缺陷菌株，来影响酿酒酵母的乙醇代谢［6-8］。肖冬光研究组利用Cre/loxP系统成功敲除了面包酵母酸性海藻糖酶基因［9］。本文利用上述遗传操作系统进行同源重组敲除POX3基因，切断消耗γ-癸内酯的一条支路，试图使耶氏酵母生产GDL的产量提高。本研究的后续内容是进行POX系列基因的组合缺失，甚至包括其他基因的组合缺失，以期考察GDL产量提高的潜力极限。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

解脂耶罗威亚酵母出发菌（Yarrowia lipolytica）

上海爱普香料有限公司提供；质粒pUG6、pSH65福建师范大学黄建忠教授惠赠，质粒图谱见图1［8，10］；DNA Marker 北京三博远志生物技术有限责任公司；培养基和细胞转化试剂 北京普博欣生物科技有限公司；PCR试剂 北京博迈德科技发展有限公司；其他试剂 全部购自上海生工。

BIO-RAD MyCycler 170-9703型基因扩增仪、BIO-RAD170-8026型凝胶呈像仪 美国Biometra公司；SpeedCycler基因扩增仪 德国耶拿公司；DYY-5型稳压稳流电泳仪、XW-80A微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；Molecular/1015c型超纯水机上海摩勒生物科技有限公司；LQP-B-型制冰机 上海安亭科学仪器制造厂；实验耗材 全部购自上海生工。

表1 POX3基因敲除组件引物序列信息

图1 pUG6质粒简图（A）和pSH65质粒简图（B）

1.2 实验方法

1.2.1 PCR引物设计 依据图2所示的引物设计原则，设计三对引物。引物L1-R1是POX3基因敲除组件扩增引物；DL1-DR1、DL2-DR2是POX3的鉴定引物。L1和R1分别具有60bp与POX3基因外侧同源的序列，另外20bp是与loxP两端同源的序列。DL1，DR2位于POX3序列内，DR1和DL2则位于loxP两端。DL1不仅可以与DR1配对，还可以与DR2配对使用，用于敲除POX3基因之后的鉴定。具体引物信息见表1。

图2 引物设计原则

1.2.2 基因敲除的基本流程 依据Cre/loxP基因敲除系统［10-11］，以质粒pUG6作为模板，使用POX3基因敲除组件扩增引物进行PCR得到POX3基因敲除组件，并转化解脂耶罗威亚酵母。再将质粒pSH65转化阳性克隆子，2%半乳糖诱导表达产生Cre酶切除KanMX基因，最后在YPD培养基中诱导质粒pSH65丢失。得到POX3基因缺陷型菌株。

1.2.3 解脂酵母基因组DNA的提取 将一80℃保藏的解脂酵母菌种在YPD琼脂培养基上划线培养至长出单菌落。挑取单菌落接于50mL YPD培养基，30℃摇瓶培养24h，提取基因组DNA［12］，琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 POX3基因敲除组件的构建 以pUG6质粒DNA为模板，用引物L1和R1进行PCR合成POX3基因敲除组件，PCR条件为：第一步：94℃预热4min；第二步：包括30个循环，每个循环包括：94℃变性30s，60℃退火40s；72℃延伸2min；第三步：72℃延伸10min。50μL反应体系中各个组分添加量：dNTP（2.5μmol/L），5μL；上游引物（2μmol/L），5μL；下游引物（2μmol/L），5μL；10×PCR Buffer，5μL；模板DNA（pUG6质粒基因组DNA，10ng/μL），0.5μL；Taq（5U），1μL；其余用I级灭菌水补足到50μL。扩增产物（1.7kb）做琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后切胶回收。

1.2.5 POX3基因敲除组件的转化 制备酵母菌感受态细胞，使用醋酸锂转化方法转化POX3基因敲除组件到感受态解脂酵母中［13-14］。

1.2.6 阳性克隆子的筛选 转化后的菌液涂在含有400mg/mL G418的YPD平板上，30℃培养3～5d，挑选在G418平板生长的阳性克隆子。

1.2.7 阳性克隆子的验证 挑取阳性克隆子接种含有400mg/mL G418的YPD液体培养基中，30℃、摇床培养24～36h获得菌体并提取菌体基因组DNA作为PCR验证的模板。使用引物L1-R1进行初次PCR验证。PCR反应条件为：94℃ 4min，（94℃ 30s，45℃ 40s，72℃ 1min）×30个循环，72℃ 10min。使用鉴定引物DL1-DR1，DL2-DR2进行第二次PCR验证，PCR反应条件为：94℃ 4min，（94℃ 30s，43℃40s，72℃ 1min）×35个循环，72℃ 10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.8 筛选标记的切除 将pSH65质粒转入PCR验证正确的阳性克隆子中，并在含有2%半乳糖的液体培养基YPG（YPD培养基中的葡萄糖改为半乳糖即为YPG）中诱导培养2～3d，取适量涂布在YPD平板上，30℃培养3d［6-10］。将得到的单菌落影印到含有G418（400mg/mL）的YPD平板中，筛选KanMX抗性标记丢失的菌株。将菌株在YPD培养基传代5～10次，诱导质粒pSH65丢失，获得POX3基因缺陷菌株。液体培养菌体提取基因组DNA，使用鉴定引物进行PCR。PCR条件为：第一步：94℃预热4min；第二步：包括30个循环，每个循环包括：94℃变性30s，40～60℃退火40s；72℃延伸2min；第三步：72℃延伸10min。PCR产物电泳检测。

1.2.9 突变株生长曲线的测定 接种原始出发菌株和POX3基因缺失突变株于50mL种子培养基中，28℃，200r/min培养16～18h，每隔2h取样检测A600值，做三批平行实验，取其平均值绘制生长曲线进行对比。

2 结果与讨论

2.1 构建POX3基因敲除组件

以提取的解脂酵母基因组DNA为模板，使用引物DL1-DR2进行PCR，得到大小与目的基因相符的扩增条带，证明了基因组中POX3基因的存在。琼脂糖凝胶电泳分析见图3A。以质粒pUG6为模板，使用引物L1-R1进行PCR得到POX3基因敲除组件。如图3B所示，在100～500bp之间出现多余的两条带可能是80nt长引物带来的非特异性产物。

图3 POX3基因组DNA（A）以及POX3基因敲除组件（B）电泳图

2.2 阳性克隆子的筛选

将验证正确的基因敲除组件PCR产物转化到酵母细胞中，转化后的菌液涂布在含有400μg/mL G418的YPD培养基上，28℃培养2～3d后G418平板出现生长较为明显的转化子（图4）。经初步计算，在本实验中500ngDNA转化后大概可以得到几十到200个左右的转化子。挑取G418平板上生长明显的克隆子，液体培养离心后获得湿菌体，提取基因组DNA为模板，使用引物DL1-DR1，DL2-DR2和引物L1-R1进行PCR验证，产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，均可得到与预期值大小相符的条带（图5），证明基因敲除序列组件已经正确整合到POX3的基因组中。

图4 POX3转化子菌落图

2.3 G418抗性基因的切除

将带有Cre重组酶的质粒pSH65转入阳性克隆子中，半乳糖诱导产生Cre酶切除KanMX基因，使细胞失去G418抗性。筛选抗性丢失的细胞，液体培养提取基因组DNA为模板，分别使用引物L1-R1和DL1-DR2进行PCR验证，扩增产物做琼脂糖凝胶电泳分析，可得到大小为194bp和781bp的目的条带，证明KanMX基因已经被正确切除（图6）。挑取连续传代后的菌株在Zeocin平板上重新划线检测，如果不再生长，证明质粒pSH65已经丢失。

图5 POX3转化子PCR验证电泳图

图6 PCR验证KanMX基因的切除

2.4 突变株生长曲线测定

为检测POX3基因敲除对菌株的生长状态和菌体产量有无影响，分别对原始出发菌株和基因缺失突变株做生长曲线测定（图7）。由生长曲线可以看到，与原始出发菌株相比，POX3基因敲除后的菌株无论在生长速率还是在菌体产量上，都没有显著差异。表明POX3基因的缺失对菌体的生长没有造成太大影响。

图7 菌株生长曲线图

3 结论

本课题利用Cre/loxp系统，以pUG6质粒为模板，使用长引物通过PCR构建了解脂酵母POX3的线性敲除组件，并在此基础上成功敲除了POX3基因。这种方法简单易行，能在基本不影响其他基因的情况下实现目的基因的准确敲除［15］。目前国内在解脂酵母中运用此技术的报道不多。由于在解脂酵母中表达生产γ-癸内酯直接牵扯到若干个需要抑制的基因［2-4］，单独缺失其中的一个基因理论上可能实现不了产量的极大值。POX3基因的敲除为进一步构建组合敲除准备了条件。当然Cre/loxP系统在敲除多个基因时可能会遇到问题，因为每次会留下一个loxP位点，为后续的重复操作带来一定的隐患，需要在基因组学分析的基础上优化设计，相关研究有待于进一步开展。

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Deletion of POX3 gene from Yarrowia lipolytica

SHI Hui-min1，WANG Fang1，HUANG Lin1，LIU Chang-jin1，*，ZHANG Zhi-zhou1，2，*
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Institute of Science and Industry Technology，Harbin Institute of Technology，Weihai 246209，China）

The POX3 gene could encode acyl-coenzyme A oxidase（acyl-CoA）in Yarrowia lipolytica and get involved in biosynthesis of γ-decalactone.POX3 knockout was mediated with a loxP-KanMX-loxP cassette centered in a PCR fragment employing 80bp primer pairs in which 60 nucleotides fully match the POX3 openreading frame.After transformed the linear disruption cassette into Yarrowia lipolytica cells，selected transformants were checked by PCR for correct integration and deletion of the target sequence.The KanMX marker was efficiently removed by transforming pSH65 plasmid and inducing the Cre expression.pSH65 was then lost after continually incubated in YPD.At last，the knockout mutant of POX3 gene was generated.The research provides a basis for combination knockouts of other genes that inhibit γ-decalactone production.

Yarrowia lipolytica；POX3；gene knockout；Cre/loxP；γ-decalactone

Q789

A

1002-0306（2010）11-0232-04

2009-12-04 *通讯联系人

师慧敏（1984-），女，在读硕士，研究方向：生物化学与分子生物学。