鱿鱼副产物自溶水解过程的生化变化及其机理

姜艳喜，张建友，丁玉庭

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

鱿鱼副产物自溶水解过程的生化变化及其机理

姜艳喜，张建友，丁玉庭*

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

系统地研究了鱿鱼加工副产物内源性蛋白酶自溶水解过程中氨基氮、总可溶性氮（TSN）、TCA可溶性氮（TCA-N）、挥发性盐基氮（TVB-N）、pH、总酸、水解度（DH）以及游离脂肪酸的变化。确定最佳自溶水解条件为：料水比1∶1、温度45℃、原始pH、水解时间39h。自溶水解39h离心后上清液中的氨基氮、TSN、TCA-N的含量分别为0.626±0.025、1.234±0.049、0.589±0.018g/100mL，TVB-N含量为 59.10±1.28mg/100mL，蛋白质水解度达到23.89%±0.13%。鱿鱼加工副产物内源性蛋白酶可以较好地水解其自身蛋白质，在39h的自溶水解过程中没有腐败现象发生。

鱿鱼加工副产物，自溶，pH，氨基氮，水解度

随着鱿钓规模的不断壮大，我国的鱿鱼产量不断增加。目前，我国鱿钓船达到400多艘，年产量70多万t，年捕捞产值60多亿元，占世界鱿鱼捕获量的17%左右，在国际鱿钓业中占据着重要地位。鱿鱼加工过程中会产生大量的副产物，主要由头、内脏、皮、鳍和小导管组织组成，其中鱿鱼皮占8%～13%，肝脏占湿重的15%左右［1］，精巢组织约占7%左右［2］。以往这些副产物常做掩埋和丢弃处理，不仅污染环境而且浪费资源［3］。近年来有关如何有效利用鱿鱼加工副产物已经成为新的研究热点。本文系统研究了鱿鱼加工副产物内源性蛋白酶自溶水解工艺，测定其指标变化并阐述原因，探索鱿鱼副产物的加工新途径。这对于鱿鱼副产物的综合利用和高值化加工具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鱿鱼加工副产物 中国水产舟山海洋渔业公司提供，实验室贮藏于-20℃冰柜中。

CR21GⅡ高速冷冻离心机 日本日立公司；752N紫外可见分光光度计、pHS-3C型pH计 上海精科实业有限公司；450Watt德国博朗多功能食品调理机 波兰博朗有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司；98-Ⅱ型强磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；THZ-82型水浴恒温振荡器 江苏金坛江南仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）型循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 自溶水解液的制备 鱿鱼副产物在冷冻状态下经切块后置于打浆机中斩拌1min成浆，分别准确称取50g浆液于250mL具塞三角瓶中，加入50g蒸馏水（水/原料，w/w），1.0mol/L的NaOH或HCl溶液调至所需的pH，于恒温振荡水浴锅内自溶水解后沸水浴煮沸20min灭酶，流水冷却，22000×g离心15min。离心后分层示意图如图 1，这与 Omid Tavakoli和 Hiroyuki Yoshida的研究结果相似［4］，分别取清液以及脂肪层进行测定分析。工艺流程如下：

鱿鱼副产物浆→加水混合→调pH→恒温水浴自溶→灭酶（100℃下保持20min）→流水冷却→离心（22000×g，15min）→离心清液、脂肪

表1 鱿鱼加工副产物的基本成分

图1 水解液离心后示意图

1.2.2 理化指标测定 水分采用直接干燥法（GB/T 5009.3-1985）；灰分采用高温灼烧法（GB/T 5009.4-2003）；脂肪采用索式抽提法（GB/T 14772-2008）；含盐量（以NaCl计）采用硝酸银滴定法（GB/T 12457 -2008）；总糖采用苯酚-浓硫酸比色法［5］；pH测定采用酸度计；总酸含量的测定采用中和滴定法（GB/T 1245-90）；氨基氮含量的测定采用甲醛滴定法（GB 5009.39-85 1996）；挥发性盐基氮采用半微量扩散法［6］；游离脂肪酸含量以及酸价的测定采用KOH标准滴定液滴定法［7］；总氮、粗蛋白、总可溶性氮采用凯氏定氮法［8］；TCA可溶性氮（TCA-N）含量的测定采用M.T.Morrissey等的方法［9］。

2 结果与讨论

2.1 鱿鱼加工副产物的宏量成分组成

经过测定，鱿鱼加工副产物中的宏量营养成分组成如表1所示。

从表1可以看出，鱿鱼加工副产物（头、足、鳍以及内脏等）蛋白质含量较高，脂肪含量中等，是较好的蛋白质资源，可以作为蛋白资源进一步加工利用，提高其经济价值，避免资源浪费以及环境污染。它可以提供饲用的水解蛋白，也可以提供食用的食品风味添加剂，以此促进鱿鱼加工业的快速发展。

2.2 自溶水解条件的确定

以氨基氮含量、挥发性盐基氮含量、水解度（DH）、可溶性氮得率以及TCA可溶性氮得率为相应指标，水解时间、温度、初始pH和料水比为影响因素进行单因素实验，确定最佳的自溶水解条件。

2.2.1 最佳料水比的确定 鱿鱼加工副产物利用内源性蛋白酶水解的反应必须在一定的水溶液中进行，这是因为蛋白酶必须溶解在相应的缓冲液中才能均匀分散在整个体系中，才能与底物接触并对其发生作用。而且有时水也作为一种反应物参与酶解反应。此外，水解过程中产生的小分子物质也可在水溶液中迅速扩散，防止局部浓度过高而抑制水解反应的进行。

由图2可以看出，随着料水比的降低，水解度（DH）、蛋白质回收率、TCA可溶性氮（TCA-N）逐渐增加，分别由料水比2∶1时的15.37%±0.46%、25.95%± 1.04%、25.99% ±1.04%增加到料水比 1∶2时的31.40%±1.26%、42.25%±1.69%、40.25%±1.61%；而氨基氮随着料水比的降低而降低，由料水比2∶1时的0.815±0.016g/100mL降低到料水比1∶2时的0.314±0.006g/100mL；说明底物浓度越小越有利于酶解进行。这是因为：a.反应是在水溶液中进行的，水在反应中有利于分子的扩散和运动。当底物浓度过高时就使水的有效浓度降低，使反应速度下降；b.一定的底物是与酶分子中一定的活性部位结合的，并形成不稳定的中间产物。过量的底物分子聚集在酶分子上就可能形成无活性的中间产物，这个中间产物是不可能分解为反应产物的。但是底物浓度并不是越低越好，底物浓度过低（即加水量过大）会使酶解液中氨基氮浓度过低，而且在以后的加工处理过程中还要进行浓缩、干燥，必然增加工艺的复杂性以及成本。

2.2.2 最佳自溶温度的确定 温度会影响酶和底物的结合、最大速率（Vmax）、酶和底物分子解离基团的解离常数（pK）、酶与抑制剂、激活剂或辅酶的结合等［10］。鱿鱼副产物内源性蛋白酶在35～65℃的自溶水解度与温度的关系如图3所示。

图2 不同料水比对自溶水解的影响

图3 不同的自溶水解温度对水解度的影响

可以看出，35～45℃的温度区间内，水解度呈现上升趋势，由 19.34% ±0.39%升高到 23.31% ± 0.47%。而45～60℃呈现下降趋势，由 23.31% ± 0.47%下降到16.05% ±0.32%；而60℃到65℃则下降不明显。65℃时为15.21% ±0.30%，而原料初始的水解度就是14.98%±0.15%，表明此时的内源酶系基本失活。由此我们确定45℃为最佳的自溶水解温度。

2.2.3 最佳自溶水解pH的选择 pH对酶促反应的影响是多方面的，过酸或过碱都可使酶空间构象改变，使酶失活。根据过酸或过碱的程度不同，酶将遭受可逆或不可逆失活，并且pH可以改变底物分子及酶的解离状态影响它们结合，从而降低酶活性［10］。

图4 不同的初始pH对氨基氮浓度的影响

由图4可以看出，离心清液中的氨基氮浓度随着初始pH的不同而发生明显的变化。在初始pH为6.0时氨基氮的浓度最高，而鱿鱼加工副产物的自身pH是6.02±0.2，所以便于控制和节约资源我们选择自然的pH进行自溶水解，即无需添加酸碱来校准初始pH。

2.2.4 最佳自溶水解时间的确定 酶解时间同样是影响水解反应的重要因素，过短则酶解反应不彻底，既造成资源浪费又达不到理想的效果，过长则由于内源混合酶系的活力逐渐降低、底物浓度减小以及产物的抑制，导致水解缓慢，此时就会浪费时间，所以应当控制适当的酶解时间。

图5 不同自溶时间对水解效果的影响

由图5可以看出，离心清液中的氨基氮浓度随着水解时间的延长而呈现上升趋势。在最初的12h内，由0.213±0.006g/100mL上升到0.578±0.017g/100mL，增加迅速；而在第12h到第39h的时间内增加缓慢，到第39h氨基氮浓度达到0.649±0.019g/100mL，较前12h增加速度明显变缓。自溶水解时间延长至63h，氨基氮浓度为0.677±0.020g/100mL。综合时耗、动力能源等因素，选择39h最为最佳的自溶水解时间。

综上所述，以氨基氮含量、水解度（DH）、挥发性盐基氮含量、可溶性氮得率以及TCA可溶性氮得率为指标，通过单因素实验确定最佳的自溶水解条件为：料水比1∶1、温度45℃、原始pH（即原料本身的pH，勿调即可）、自溶水解时间39h。

2.3 自溶水解液pH和总酸含量的变化

在最适自溶条件下，水解液的pH和总酸含量的变化如图6所示。

由图6可以看出，鱿鱼废弃物自溶水解过程中pH略有下降，由自溶水解初期的6.10±0.05到水解基本结束时的5.90±0.01。而在水解初期水解离心清液的pH下降速度较迅速，主要是因为氨基酸中羧基的解离度远大于氨基的解离度，氨基酸的溶液会释放出大量的质子；再则由于肌肉中大部分的有机酸类成分迅速溶出，导致水解液的pH降低。鱼贝类肌肉的酸性组分包括乳酸、丙酸、丙酮酸、草酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸等，由图6可以看出，大部分肌肉的酸性组分在自溶水解的前6h即释放出来，此时总酸含量为1.350±0.027g/100mL，而后上升趋势变缓。这是由于自溶水解6h后，鱿鱼废弃物的微观组织结构已基本被破坏，自溶水解物由半固态变为可以自由流动的液体，随着自溶时间的延长，总酸的含量增加缓慢，而这个阶段增加的有机酸主要来自微生物生长产酸，经过39h的自溶水解后，水解离心液中总酸含量达到1.581±0.032g/100mL。

图6 鱿鱼废弃物自溶水解液pH和总酸含量的变化

2.4 水解液中氨基氮、总可溶性氮以及TCA可溶性氮的变化

在最适自溶条件下的水解液的氨基氮、总可溶性氮以及TCA可溶性氮的变化如图7所示。

图7 鱿鱼废弃物自溶水解液中氨基氮、总可溶性氮和TCA可溶性氮的含量的变化

水解前水解液有0.837±0.033g/100mL的可溶性氮溶于水，这主要包括肌浆蛋白氮，内源酶已经酶解的氨基氮。水解前的6h内，水解液中水溶性蛋白质（即总可溶性氮）迅速增加，这是由于水不溶性的蛋白质在内源蛋白酶的作用下水解成为多肽和氨基酸而溶于水，随后的时间内总可溶性氮的含量保持着小幅度的增长。与总可溶性氮不同的是，水解液中氨基酸含量（即氨基氮的含量）在0～9h都保持着相对较大幅度的增长，由0h的0.374±0.015g/100mL到9h的0.529±0.021g/100mL，9h后增长变缓，原因在于开始时内脏的多种蛋白酶酶活力较强，催化速率较快，生成的肽、氨基酸成分较多，随着自溶水解的延长，蛋白酶活力逐渐减弱，催化速率逐渐降低。自溶水解基本结束时水解离心清液中的氨基氮的含量达到0.626±0.025g/100mL。

2.5 鱿鱼废弃物自溶水解过程中水解度（DH）和TVB-N含量的变化

在最适自溶条件下的水解度（DH）和TVB-N含量的变化如图8所示。

图8 鱿鱼自溶水解过程中水解度的变化

图8显示了鱿鱼加工副产物自溶水解过程中DH随时间的变化趋势，可以看出，在最初的9h内水解度增加比较明显，而后水解度增加变缓。当水解到39h时，水解度达到23.89%±0.13%，在最初的0h有水解产物是因为鱿鱼副产物产生的过程中，所处环境的影响因素使内源性蛋白酶也已发挥作用产生了游离氨基酸。水解度在开始增加较快是由于内源性的组织蛋白酶在开始时活力较高，催化蛋白水解的速率快，氨基酸的含量增加较快。随着时间的延长，酶活力逐渐降低，以及底物浓度变小和产物的抑制作用，催化速率变小，导致DH增加缓慢。

鱿鱼副产物自溶开始时的TVB-N值为23.50± 1.20mg/100mL，在第 9h时达到 44.20±1.37mg/ 100mL，增加比较迅速；而后趋于平缓，30h时达到53.11±0.75mg/100mL；随后呈现明显的上升趋势，到第39h达到59.10±1.28mg/100mL。自溶水解过程中TVB-N含量增加的原因可能是由于蛋白质和氨基酸在其本身含有的脱羧酶、脱氨酶和细菌生长所产生的细菌性脱氨酶、脱羧酶共同作用下脱氨的结果［11］。

2.6 水解液中游离脂肪酸的变化

在最适自溶条件下的游离脂肪酸的变化和酸价的变化如图9所示。

图9 鱿鱼废弃物自溶水解过程中游离脂肪酸和酸价的变化

游离脂肪酸和酸价的多少是衡量油脂好坏的重要指标之一。实验结果表明，水解15h后，油脂的酸价达到 21.34±0.42mgKOH/g，39h达到 25.86± 0.51mgKOH/g。酸价在水解过程中不断上升的主要原因是脂肪被内源性脂肪酶水解以及脂肪氧化的结果［12］。

3 结论

以氨基氮含量、DH、TVB-N含量、可溶性氮得率以及TCA可溶性氮得率为指标通过单因素实验确定最佳的自溶水解条件为：料水比1∶1、温度45℃、原始pH（即原料本身的pH，勿调即可）、自溶水解时间39h。研究鱿鱼废弃物的自溶水解过程中的各种理化指标的变化并分析其变化原因，得出：鱿鱼加工副产物的自溶水解过程是利用自身的内源蛋白酶系，借助于适宜的反应条件将自身的蛋白质分解为氨基酸、多肽的过程。其中氨基氮、总可溶性氮以及TCA可溶性氮的含量随着水解时间的延长而增加；伴随的还有挥发性盐基氮此类影响风味的物质，它是由自身的脱羧酶、脱氨酶和细菌滋生产生的细菌性脱氨酶、脱羧酶共同作用下将蛋白质和氨基酸脱氨产生的氨及胺类等碱性含氮物质脱除；同时内源性的脂肪酶以及脂肪本身的氧化作用也会导致自溶过程中的游离脂肪酸的含量增加。

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Biochemical changes in the squid processing wastes’auto-hydrolysate and mechanism analysis

JIANG Yan-xi，ZHANG Jian-you，DING Yu-ting*
（Zhejiang University of Technology，College of Biological and Environmental Engineering，Hangzhou 310014，China）

Biochemical changes in auto-hydrolysis of squid processing wastes were investigated.The optimum condition of auto-hydrolysis were as follow：material-water ratio 1∶1，temperature 45℃，the original pH，the time of auto-hydrolysis 39h.Results showed that amino nitrogen，TSN，TCA-N，TVB-N and the degree of hydrolysis was 0.626±0.025，1.234±0.049，0.589±0.018g/100mL，59.10±1.28mg/100mL，23.89% ±0.13%，respectively.ln a word，the endogenous protease in squid processing wastes can hydrolyze protein effectively and there was no putrefaction in the processing.

squid by-products；auto-hydrolysis；pH；amino nitrogen；the degree of hydrolysis

TS254.9

A

1002-0306（2010）12-0142-04

2009-12-16 *通讯联系人

姜艳喜（1983-），女，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。基金项目：浙江省科技厅科研社会发展项目（2008C23021）。