复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆的饲料化研究

陈 合，余建军，舒国伟，李世玉，王利红，王雅凤

（陕西科技大学生命与工程学院，陕西西安710021）

复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆的饲料化研究

陈 合，余建军*，舒国伟，李世玉，王利红，王雅凤

（陕西科技大学生命与工程学院，陕西西安710021）

利用复合酶在其最优条件下降解高温蒸煮玉米秸秆，然后接入混合酵母同步发酵产菌体蛋白。确定了复合酶降解的最优条件：4g底物（蒸煮秸秆3.072g）加入30mL pH4.8柠檬酸缓冲液，调pH4.8，121℃灭菌20min，待冷却，无菌操作下加入25mg纤维素酶、10mg木聚糖酶、6mg β-葡聚糖酶、1.3mg果胶酶，在50℃、100r/min条件下酶解16h，产糖量0.9349g/30mL。混合酵母发酵实验结果表明，玉米秸秆粗蛋白含量为27.125%，是原秸秆蛋白含量的4.13倍，效果显著，酶用量低，发酵周期短。

复合酶，高温蒸煮，玉米秸秆，混合酵母，饲料

玉米秸秆细胞壁结构致密，木质素作为外衣保护着纤维素和半纤维素免受酶的降解［1］。因此要用酶法进行有效降解，需对秸秆预处理［2］。本课题组对玉米秸秆进行高温蒸煮预处理研究时，效果非常好，以降解率为目标研究复合酶降解条件时，降解率达70.03%。国内外很多研究人员对秸秆进行了同步发酵研究［3-5］，通过微生物发酵解除了降解所得糖对酶的抑制。但酶活最佳温度一般在37～60℃之间，因此同步发酵时间会比较长［6］，且微生物长时间为维持自身新陈代谢会浪费大量碳源，或者需加大酶量弥补不足。本文研究目的为弥补同步发酵缺陷，先让复合酶在其最优条件下降解高温蒸煮玉米秸秆一定时间，以便其降解出尽可能多还原糖，作为后续发酵的启动碳源，然后再接入混合酵母进行同步发酵，缩短秸秆蛋白饲料化时间、节省酶用量、提高还原糖利用率。

1 材料与方法

1.1 实验材料

玉米秸秆 陕西省西安市未央区刚采收完玉米棒的新鲜青秸秆，待晾干，用小型高速粉碎机将原秸秆粉碎，过40目筛，经180℃高温蒸煮1.5h，60℃烘干至恒重（0.768g高温蒸煮秸秆相当于1g原秸秆）；产朊假丝酵母（利用六碳糖）、嗜单宁管囊酵母（利用戊糖） 均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），编号分别为1807、1771；纤维素酶10000U（经 QB2583-2003的 FPA测定方法，滤纸酶活3500U，以下纤维素酶活均表示其滤纸酶活）、木聚糖酶10000U、β-葡聚糖酶10000U、果胶酶30000U 均来自肇东国科北方酶制剂有限公司；酵母粉、蛋白胨生化试剂，北京奥博星生物技术有限公司；产朊假丝酵母活化培养基（g/L） 葡萄糖20、蛋白胨20、酵母粉10，250mL三角瓶配制100mL，121℃灭菌20min，斜面菌种试管接入一环，培养20h；嗜单宁管囊酵母与上同，葡萄糖换为木糖；其余药品 均为分析纯。

1.2 实验方法

表1 各单因素条件表

基本酶解条件：称取底物质量1.5g（以原秸秆质量计），加入30mL pH4.8柠檬酸缓冲液，调pH至4.8，121℃灭菌20min。然后加入纤维素酶20mg（滤纸酶活70U）、β-葡聚糖酶8mg（80U）、木聚糖酶8mg（80U）、果胶酶 2mg（60U），温度 50℃，转速100r/min，时间23h。固定其它基本条件，做单因素实验，各单因素条件如表1所示。最后做正交实验，得到最优条件，并验证。

经最适条件降解秸秆一定时间后，接入4%产朊假丝酵母、6%嗜单宁管囊酵母及相应无机盐辅料，在30℃发酵51h，3500r/min离心15min，测上清液可溶性蛋白含量，烘干沉淀物并测粗蛋白含量。

1.3 测定方法

还原糖测定采用DNS法；粗蛋白测定采用微量凯氏定氮法；可溶性蛋白测定采用考马斯G250法。

2 结果与分析

2.1 各种酶量对产糖量影响

由图1（为便于将4种酶解效果曲线图整合在一块，特用相应酶活表示）可知，各种酶量达到一定量后，产糖量不再增加，因为糖浓度达到一定值，会对酶产生严重抑制作用。纤维素酶添加量对产糖影响比较大，一方面因为玉米秸秆含纤维素量高，另一方面纤维素难降解，加大酶剂量，作用显著；木聚糖酶对产糖影响其次，虽然半纤维素易降解，但其含量很高，所以加大酶量效果明显。另两种酶对产糖量影响比较小，可能是纤维素酶本身含有大量内外切葡聚糖酶及β-葡聚糖苷酶缘故，使得β-葡聚糖酶添加量影响轻微，而秸秆果胶含量很低，所以其对产糖量影响也比较低。确定各种酶加量为：纤维素酶20mg（70U）、β-葡聚糖酶8mg（80U）、木聚糖酶12mg（120U）、果胶酶2mg（60U）。

图1 各种酶量与降解所得糖关系

2.2 底物添加量对产糖量影响

图2 底物添加量与产糖量关系

由图2可知，随着底物添加量增大，底物对产糖量影响逐渐减小，特别是其添加量在1.5g以上时，影响明显放缓，说明糖浓度对复合酶降解有明显抑制作用。由于本实验研究目标是使混合酵母接入发酵前有尽可能高的产糖量，而混合酵母接入发酵后，随着糖浓度降低，对复合酶抑制作用减小，即可达到边糖化边发酵目的，因此在这里，选择底物添加量为3g。

2.3 时间对产糖量影响

由图3可知，在酶解16h之后，时间对产糖量基本无影响，已处于近似水平曲线。说明糖浓度已达到几乎完全抑制复合酶的酶活，故选择酶解时间为16h。

图3 时间与产糖量关系

2.4 摇床转速对产糖量影响

由图4可知，复合酶降解高温蒸煮秸秆需要一定摇床转速，通过振荡，以便复合酶更好地与相应被降解物接触，达到良好降解效果，故选择摇床转速100r/min即可。

图4 摇床转速与产糖量关系

2.5 温度对产糖量影响

由图5可知，温度对产糖量影响很大，在一定范围内，升高温度可提高复合酶酶活，加快底物降解；然而温度过高会降低酶的稳定性，使其失活，从而影响酶水解的作用效果，故酶解温度选择50℃。

表2 正交实验设计水平及正交结果

图5 温度与产糖量关系

2.6 pH对产糖量影响

由图6可知，pH对产糖量影响也很大。复合酶对pH很敏感，因为pH过高或过低会改变酶解离状态，影响酶与底物结合，故复合酶的pH条件确定为pH4.8。

图6 pH与产糖量关系

2.7 复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆条件的优化

影响复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆的主要因素是A（纤维素酶）、B（木聚糖酶）、C（β-葡聚糖酶）、D（果胶酶）、E（底物）、F（时间）、G（pH）、H（温度），根据以上单因素实验设计了以产糖量为指标的L27（313）正交实验，其中加入交互作用因素：A×B、A×C，摇床转速定为100r/min。各条件的因素水平及正交结果，如表2所示。

对表2的原完整正交表进行方差分析，结果如表3所示。

由方差分析表3可知，对产糖量影响的因素大小为：H＞F＞E＞A＞A×B＞A×C＞B=D＞G ＞C。其中：A、E、F及H为高度显著，应选取较好水平为A3E3F3H2。其余均无显著性，可忽略交互作用分析，从节省酶量及酵母发酵时pH需要高点的角度，选取为B1C1D1G2。

由于最优条件不在正交实验表中，故补做最优条件三组平行实验，结果稳定，平均产糖量达到0.9349g/30mL，比以上实验号效果都要好，故选择最优条件：A3B1C1D1E3F3G2H2，即复合酶降解高温蒸煮玉米秸秆的最优条件为：25mg纤维素酶、10mg木聚糖酶、6mg β-葡聚糖酶、1.3mg果胶酶、4g底物（蒸煮秸秆3.072g），16h、pH4.8、温度50℃。

表3 方差分析表

复合酶在最优条件下降解高温蒸煮玉米秸秆16h后，进行同步发酵，摇床转速仍为100r/min。结果，测得上清液的可溶性蛋白几乎为零，沉淀物粗蛋白含量为27.125%，是原秸秆蛋白含量6.56%的4.13倍，且此时测得上清液中还原糖含量1%左右，说明还未发酵彻底，玉米秸秆饲料蛋白含量还有进一步提高的潜力，本课题组对此研究还在进行中。

3 结论

高温蒸煮玉米秸秆的最优复合酶降解条件为：4g底物（蒸煮秸秆3.072g）加入30mL pH4.8柠檬酸缓冲液，调pH4.8，121℃灭菌20min，待冷却，无菌操作下加入25mg纤维素酶、10mg木聚糖酶、6mg β-葡聚糖酶、1.3mg果胶酶，在50℃、100r/min条件下酶解16h，产糖量0.9349g/30mL。经初步混合酵母发酵实验，玉米秸秆粗蛋白含量为27.125%，是原秸秆蛋白含量的4.13倍。实验效果显著，酶用量低，发酵周期短。

［1］Wyman CE，Yang B.Cellulosic biomass could help meet California′s transportation fuel needs［J］.California Agriculture，2009，63（4）：185-190.

［2］Su Donghai，Sun Junshe，Liu Ping，et al.Effects of Different Pretreatment Modes on the Enzymatic Digestibility of Corn Leaf and Corn Stalk［J］.Chinese J Chem Eng，2006，14（6）：796-801.

［3］Takagi M，Abe S，Suzuki S，et al.A method for production of alcohol directly from cellulose using cellulase and yeast［J］. Bicoconversion Symposium，1977：551-571.

［4］Wyman CE，Spindler DD，Grohmann K，et al.Simultaneous saccharification and fermentation with the yeast Brettanomyces clausenii［J］.Biotechnol Bioeng Symp，1986，17：38.

［5］罗灵芝，李春玲，袁敬伟，等.响应面法优化玉米秸秆同步酶解发酵产乙醇条件［J］.生物加工过程，2009，7（3）：27-33.

［6］Kadam KL，Rydholm EC，McMillan JD.Development and validation of a kinetic model for enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass［J］.Biotechnology Progress，2004，20（3）：698-705.

Study on feed of steam-pretreated corn stover degraded by complex enzyme

CHEN He，YU Jian-jun*，SHU Guo-wei，LI Shi-yu，WANG Li-hong，WANG Ya-feng
（College of Life Science&Engineering，Shaanxi University of Science&Technology，Xi’an 710021，China）

Mixed yeast was inoculated for simultaneous saccharification and fermentation and for yielding of mycoprotein，later steam-pretreated corn stover was degraded by complex enzyme under the optimum conditions.The optimal conditions were：4g substrate（steam-pretreated corn stover 3.072g）was put in 30mL citrate buffer solution（pH4.8）and adjusted pH4.8 before pasteurization at 121℃for 20min.Then putting 25mg cellulase，10mg xylanase，6mg β-glucanase and 1.3mg pectase in it，under 50℃，the 100r/min condition enzymolysis 16h，the amount of producing the sugar was 0.9349g/30mL.The content of corn stover’s crude protein was 27.125%as a result of mixed yeast fermentation，and 4.13 times of original stover.The result was highly visible，low enzyme dosage and short fermentation period.

complex enzyme；steam pretreatment；corn stover；mixed yeast；feed

TS201.1

A

1002-0306（2010）12-0176-04

2009-11-24 *通讯联系人

陈合（1956-），男，教授，研究方向：食品生物技术与工程。

陕西省科技攻关项目（2007JK01-13-2）；咸阳市科技攻关项目资助（K0311-2）。