应用新型调制荧光成像系统(Imaging-PAM)原位评估底泥毒性的方法*

虞 龙 苗秀珍 于 洋 张 民 阳 振 叶琳琳 孔繁翔

(1.南京工业大学生物与制药工程学院，南京，210009;2.中国科学院南京地理与湖泊研究所，湖泊与环境国家重点实验室，南京，210008)

应用新型调制荧光成像系统(Imaging-PAM)原位评估底泥毒性的方法*

虞 龙1＊＊苗秀珍1于 洋2张 民2阳 振2叶琳琳2孔繁翔2

(1.南京工业大学生物与制药工程学院，南京，210009;2.中国科学院南京地理与湖泊研究所，湖泊与环境国家重点实验室，南京，210008)

应用新型调制叶绿素荧光成像系统Imaging－PAM，通过最大叶绿素荧光量子产量(Fv/Fm)、实际荧光量子产量(YⅡ)指标的测定原位评估了友谊河底泥对斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)的毒性效应.数据显示，在友谊河底泥悬浮液中，栅藻的Fv/Fm和YⅡ值在12h前快速上升，12h后呈现出时间－效应型曲线，72h时Fv/Fm和YⅡ分别下降至对照的44%和35%，Fv/Fm和YⅡ的半抑制时间分别为57h和45h.同时，通过对友谊河底泥样品中重金属含量的检测，计算地积累指数(Igeo)，得出友谊河底泥中的Hg、Zn和Cu分别为严重污染，重污染和偏重污染水平，这可能是影响藻类光合作用的主要污染物.本研究为进行底泥毒性评估提供了新的原位分析方法.

斜生栅藻，底泥毒性，叶绿素荧光量子产量，Imaging－PAM.

目前，沉积物生物评估进展缓慢，其原因主要是由于检测手段的限制，很难将测试种群(如藻类、细菌)与沉积物颗粒有效区分并进行生理生化水平的检测.而使用沉积物浸出液的传统方法又不可避免地会出现氧化还原、金属形态的变化、胶体的破坏等诸多问题，与真实环境差异较大.新型调制荧光成像系统(Imaging－PAM)是结合Microscopy版探头与特制荧光显微镜的一种在线叶绿素荧光分析系统，可以探测和研究植物光合生理状况及各种外界因子对其细微影响.此技术具有功能强大，操作极其简单快速，对受测试的藻体无损伤以及测量结果在屏幕上可见的优点，不仅如此还可以对底泥进行原位的生物分析，已经在水生生物和高等植物上有所应用［1－2］.2004年Ralph等人用它来研究海草的动力学［3］，2005年Podola等人以微藻做指示生物，以调制叶绿素荧光为指标，结合荧光成像技术批次检测挥发性有机污染物［4］.在国内Imaging－PAM主要用于考察玉米、冬小麦、麻枫树、木兰植物、三裂叶蟛蜞菊等逆境胁迫下高等植物叶绿素荧光的变化［5－9］.林阿朋等运用Microscopy－Imaging－PAM对青岛海域漂浮和沉降浒苔进行光合作用研究［10］.

本文应用Imaging－PAM技术，通过显微镜成像系统对底泥颗粒和栅藻细胞进行区分，根据栅藻细胞光合作用变化原位评估底泥毒性，为水污染控制提供参考.

1 实验部分

1.1 实验材料

斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus)采用BG11培养基，在250ml的三角瓶中加入100ml的培养液，培养温度(26±1)℃，光照强度为(30±10)μmol·m－2·s－1，光暗比为12∶12，静置培养，每天早晚定时振荡两次.

1.2 底泥的采集与处理

2009年5月在南京选择重金属污染较严重友谊河－友谊桥附近采集底泥样品，并以玄武湖东南湖湾较为干净的底泥作为对照.使用底泥采样器采集沉积物上层0—3cm深处100g泥样，手工挑除石子，贝壳等杂质.为减少采样误差，每个采样点附近分别采集底泥样3个，混合后分别密封于无毒聚氯乙烯袋或桶中，带回实验室4℃保存.

把采集来的底泥冷冻干燥后，稍加研磨后用250目筛过滤后得淤泥和沙，将泥沙比例固定在1∶9得到最终泥样.经预实验，沉积物浓度优化以10%浓度为最佳，即9ml的水(经0.45μm膜过滤)中加入1g泥样.取3支30ml的聚碳酸酯管分别加入最终泥样1g，分别向各样品管轻轻加入9ml的水(经0.45μm膜)过滤.

1.3 实验方法

无菌条件下取对数生长期的斜生栅藻藻液适量用蒸馏水冲洗和离心(4000r·min－1，5min)3次后接入样品管，使初始藻细胞的密度为(5—9)×105个 cell·ml－1，于3h，12h，24h，36h，48 h和72h 胁迫培养.光照强度为(30±10)μmol·m－2·s－1，温度为(26±1)℃，光暗比为12∶12.

利用调制荧光成像系统Imaging－PAM(Walz，Germany)测定PSII的最大量子产额(Fv/Fm)以及实际量子产率－YⅡ.分别在0 h，3h，12h，24h，36h，48 h和72h后取不同处理组的藻培养液10μl于载玻片上进行测定，每处理取3个平行，每个平行5个视野，每个视野随机选择15—20个藻细胞圈定见图1，取其荧光动力学参数的平均值，测定之前样品至少暗适应15 min，所有操作均在背景光强低于1μmol·m－2·s－1的环境中进行.仪器的作用光强度均设为默认值80 μmol·m－2·s－1，测量光低于0.5 μmol·m－2·s－1，增益设置为9.暗适应后的最大光合效率Fv/Fm，光适应下的实际效率YⅡ的计算按文献公式由仪器自动给出［11］.

图1 底泥悬浮液中栅藻细胞的荧光图像(200倍放大)Fig.1 The fluorescence image of Scenedesmus obliquus cells in sediment suspension(amplification of 200)

1.4 重金属离子的测定

取底泥样品2—3g为佳.玛瑙研钵粉碎至≤200目，存放于纸质样品袋中，105℃以下烘干.盐酸硝酸氢氟酸高氯酸敞开消解.用电感耦合等离子体原子发射光谱仪(ICP－AES)检测出6个对栅藻生长敏感的重金属元素(Co，Cu，Mn，Ni，Pb，Zn)的数据，用来检测底泥中Hg元素的样品只需用玛瑙研钵粉碎至≤100目，在50℃以下烘干用CVAAS方法在直接汞分析仪上测出.

2 结果与讨论

2.1 不同位点底泥悬浮液中栅藻光合作用指标的变化

栅藻在污染底泥中胁迫0h，3h，12h，24h，36h，48 h和72h后Fv/Fm的变化见图2，Fv/Fm在3h时下降为对照组的72%，在12h上升与对照相当，在12h后又开始下降，在24h，48h，72h时分别为对照的73%，57%，44%.在72h时其值为0.29.

栅藻在污染底泥中胁迫0 h，3h，24h，36h，48 h和72h后在第一个饱和脉冲条件下的YⅡ(Yi)值的变化见图2.YⅡ在3h时快速的下降，为对照组的63%，在12h上升为对照的76%，在12h后又开始下降，在72h时其值为0.23，是对照的35%.

本实验除了以量子产量为衡量指标，也应用了快速光响应技术，在不同处理时间的底泥悬浮溶液中测定栅藻细胞的相对电子传递速率(rETR)的快速光响应曲线见图3.各处理组的rETR值随光照强度的增加呈逐渐增加趋势;在12h时栅藻细胞的rETR光响应曲线增加趋势与对照相当，随着胁迫时间越长，增加趋势越缓慢，表明随着胁迫时间的延长，栅藻植株耐光抑制能力显著降低.

图2 不同时间底泥悬浮液Fv/Fm与YⅡ的变化Fig.2 Changes of Fv/Fm and YⅡin sediment suspension with exposure time

图3 不同光强下底泥悬浮液表观电子传递速率(mean±se)的变化Fig.3 Changes of rETR(mean ± se)in sediment suspension under various light intensity

12h后的胁迫时间，无论是Fv/Fm还是YⅡ值都表现出时间－效应曲线的变化规律，可计算出在这一时间段内底泥悬浮液中栅藻细胞经胁迫后的半抑制时间，栅藻细胞在友谊河底泥悬浮液中连续暴露72h时间内Fv/Fm和YⅡ荧光指标的半抑制时间分别为57h和45h.

最大光量子产量Fv/Fm，即PSⅡ原初光能转换效率是衡量PSII完整性的指标.在正常生理状态下，Fv/Fm是一个很稳定的值，藻类约为0.65［12］.当藻类受到胁迫时，其值显著下降［13］.YⅡ则是光系统Ⅱ的有效量子产量，表示植物体光合机构将吸收的光能进行转化的能力.而相对电子传递速率(rETR)是反映实际光强下吸收的光能沿光合电子传递链被传递利用的多少，可以在相当程度上反映植物的光合速率的大小［14－15］.

经毒性底泥悬浮液胁迫后的栅藻细胞的叶绿素荧光指标Fv/Fm，YⅡ和rETR与对照相比在3—12h内迅速下降后再显著升高，其中Fv/Fm和rETR在12h时与对照相当.三者在12h后又开始降低，在短时间0—3h内有可能是沉积物颗粒遮挡了藻细胞而影响藻细胞的光合作用从而抑制其生长，栅藻细胞对于这种泥水混合的环境一时还难以适应，表现为光合作用下降.之后到12h时底泥悬浮液对于栅藻的生长没有表现毒性反而促进其生长，可能的原因是底泥中毒性物质的释放量还很少呈现为Hormesis现象(毒物兴奋效应)，与Calabreseh和Baldwin的双相剂量－反应模式符合［16］，还有一种可能是由于沉积物会释放出营养物质最初可以促进藻的生长，潜在地遮蔽了污染物的毒性效应［17］.随着胁迫时间的延长，底泥中重金属离子释放增加，改变原生质膜的渗透性，使K+从细胞内丧失，影响藻类的生长和光合作用［18］.在72h时 Fv/Fm 和 YⅡ分别降低到0.29和0.23.Schansker等发现，Fv/Fm 值大于0.44时，PSⅡ活性随着Fv/Fm的降低而降低，当小于0.44时就完全失去活性，表现出反应中心的破坏，光合效率降低［19］.

2.2 不同位点底泥中地积累指数与污染程度

考虑到友谊河多年来接纳了两岸的工业废水和生活污水，而多种污染物中重金属离子作用尤为明显.为了对水质污染程度进行大致的评价并与藻类毒性实验结果相比较，我们以常用的地积累指数(Igeo)［20］来对沉积物中重金属的污染程度进行评价.表1列出了友谊河底泥中主要重金属含量及重金属地球化学背景值(采用中国土壤元素的几何平均值，mg·kg－1)，以及运用地积累指数(Igeo)算出的友谊河主要重金属元素的污染情况.从表1中可以看出，友谊河底泥中Hg，Zn和Cu元素的含量很高，达到重污染的水平.

重金属离子对于藻类有严重的胁迫作用，能引起藻类生理代谢功能紊乱，减少细胞色素，抑制光合作用致使叶绿素荧光值变低.因此栅藻细胞光合作用下降可能主要来源于Hg，Zn和Cu等离子的联合作用.这与Mallick和Mohn发现的斜生栅藻暴露于含Cu，Cr，Ni，Cd，Zn等重金属的水体中12h后Fv/Fm下降的结果相一致［21］.

表1 友谊河主要重金属元素含量及污染情况Table 1 Main heavy metal concentrations and pollution grades in Friendship River sediment

3 结论

本研究运用调制荧光成像系统Imaging－PAM检测污染底泥中栅藻光合作用的变化，得出在重金属离子为主的底泥污染物作用下，栅藻的Fv/Fm和YⅡ值在12h前快速上升，12h后呈现出时间－效应型曲线;相对电子传递速率(rETR)随光照强度的增加呈逐渐增加趋势，随着胁迫时间越长，增加趋势缓慢.由此可见，Imaging－PAM作为一种新型的在线叶绿素荧光分析技术可以原位快捷地应用于沉积物污染评估，为环境风险评价进一步接近真实环境提供一定基础.

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AN IN-SITU ASSESSMENT OF SEDIMENT TOXICITY WITH THE APPLICATION OF IMAGING-PAM

YU Long1MIAO Xiuzhen1YU Yang2ZHANG Min2YANG Zhen2YE Linlin2KONG Fanxiang2
(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing，210009，China;2.Nanjing Institute of Geography＆ Limnology，Chinese Academy of Sciences，State Key Laboratory of Lake Science and Environment，Nanjing，210008，China)

New modulated chlorophyll fluorescence imaging system Imaging－PAM has been applied as an effective detection in short－term bioassays with Scenedesmus obliquus. Maximum quantum yield of chlorophyll fluorescence(Fv/Fm)and the actual fluorescence quantum yield(YⅡ)were used to assess the toxicity of the sediment from Youyi River.Data showed that in 12h exposure there was a rapid increase in Fv/Fm and YⅡof Scenedesmus obliquus in the sediment suspension of Youyi River，whereas after 12h a time－response curve appeared.In 72h the Fv/Fm and YⅡdropped to 44%and 35%of that of the control respectively，the halfinhibition time of Fv/Fm and YⅡwere 57h and 45h.At the same time by detecting the concentration of heavy metals in the sediment of Youyi River，the index of geoaccumulation(Igeo)was accounted as follows:Hg，Zn，and Cu reached serious pollution，heavy pollution and partial heavy pollution levels respectively.They are the probobly the primary contaminants affecting the photosynthesis of algae.This study may provide a new method to assess the toxicity of sediment in situ.

Scenedesmus obliquus，in－situ assessment of sediment toxicity，quantum yield of chlorophyll fluorescence，Imaging－PAM.

2009年12月24日收稿.

*国家自然科学基金项目(20807043);中国科学院南京地理与湖泊研究所所长基金(07SL021001)资助.

＊＊通讯联系人，Tel:15850560573;E－mail:bilbobaggins@126.com