添加不同营养助剂对石油污染土壤生物修复的影响＊

乔 俊 陈 威 张承东

(南开大学环境科学与工程学院,天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室,教育部环境污染过程与基准重点实验室,天津,300071)

添加不同营养助剂对石油污染土壤生物修复的影响＊

乔 俊 陈 威 张承东＊＊

(南开大学环境科学与工程学院,天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室,教育部环境污染过程与基准重点实验室,天津,300071)

实验室条件下研究NPK复合肥、诺沃肥和腐殖酸三种物质不同配比添加对石油污染土壤的生物修复效果.在 60d的修复实验中,定期取样测定土壤含油量、总异养菌数、石油烃降解菌数和脱氢酶活性,并采用 PCR-DGGE技术研究修复过程中微生物多样性变化.结果表明,NPK肥的添加和 NPK肥-诺沃肥-腐殖酸复合添加能够提高土壤中微生物的数量、微生物多样性和脱氢酶活性.在含油量为 84600 mg·kg-1的土壤中,添加营养助剂的处理 60d后石油烃降解率为 31.3%—39.5%,不添加营养助剂的石油烃降解率仅为 3.5%.NPK肥-诺沃肥-腐殖酸复合添加对石油烃的降解率要高于NPK肥的单独添加 (高 8%),其原因可能是诺沃肥-腐殖酸能够有效提高土著微生物的活性,增加微生物的多样性,增强石油烃的降解.

石油,生物修复,生物刺激,微生物活性,PCR-DGGE.

石油在勘探、开采、运输以及储存过程中不可避免地污染土壤生态系统,进入土壤的石油可通过径流、渗透、侵蚀等作用进一步污染地表水和地下水,并可通过食物链影响人类的健康.生物修复利用土壤中的微生物将有毒的有机物分解或降解成为低毒或无毒物质.生物刺激 (Biostimulation)是生物修复重要的策略之一.它通过提供微生物生长所需要的氮磷等营养元素,或改善微生物生长的环境条件,来刺激土著微生物的生长加速石油烃降解[1,2].

许多研究表明,诸如堆肥产物、市政污泥、牛粪、壳质素、农作物/植物茎杆、锯屑、发酵残渣和腐殖酸等多种营养物质,都是刺激土著微生物生长的营养助剂[3—6].这些营养助剂作用原理有提供碳氮源等营养物质;引入外来菌群,丰富土壤环境中的微生物数量;诱导降解性酶的产生;或起到类表面活性剂作用等.而且这些物质都是廉价的,有些甚至是废弃物,将这些物质用于土壤修复既可达到修复目的,还有效降低了修复成本.

本文旨在构建用于石油污染土壤修复的廉价高效复合营养助剂.选择腐殖酸、诺沃肥和氮磷钾复合肥三种物质,在实验室条件下通过添加不同配比营养助剂模拟原位修复石油污染土壤,定期监测土壤中石油烃降解、微生物菌群(数目和多样性)以及脱氢酶的变化规律,为大面积生物修复石油污染土壤提供科学依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料

土壤取自山东省胜利油田滨一污水处理站的油泥.土壤在室温背阴处风干,过 2 mm筛.采用常规方法分析土壤的有机质、水解氮、速效磷等基本理化性质 (见表1).

NPK复合肥 (石家庄绿洲肥料有限公司)其中 N,P,K比例为 6∶5∶4.腐殖酸 (石家庄绿洲肥料有限公司)基本理化性质如表1所示.诺沃肥 (诺维信 (中国)生物技术有限公司天津开发区分公司)是诺维信酶制剂公司发酵生产后的残余液,再经氢氧化钙作用后的沉淀物,属于生产废弃物,含有大量N和 P等营养元素和钙.诺沃肥经风干过 2mm筛,其基本理化性质见表1.

表1 土样、腐殖酸、诺沃肥的理化性质Table 1 Physical-chemical properties of the soil,humic acid and NovoGro

1.2 生物修复实验

实验设置 3个处理 1个对照,每个处理设 3个平行,每个处理土样 700g.对照 (CK)不添加任何营养助剂;F组添加 NPK复合肥,调节 C∶N为 10∶1;FL组添加 5%(W/W)诺沃肥-腐殖酸 (1∶1)混合物,并施加 NPK肥调节 C∶N为 10∶1;FH组添加 10%(W/W)诺沃肥-腐殖酸 (1∶1),同上用 NPK复合肥调节至相同碳氮比.

所有处理组均置于人工气候箱中恒温培养,温度 25±1℃,光照/黑暗 (12 h/12 h),定期翻土保持土壤好氧状态,定期浇水保持土壤含水率为 20%(W/W).实验周期为 60d,在 7,15,30,45和60d用四分法取样测定各项指标.

1.3 实验分析

称重后的铝盒内加入适量潮湿土壤样品,在 105℃下烘至恒重,计算土样的含水率.采用重量法[7]测定土壤中的含油量.用称重的平底烧瓶装入适量二氯甲烷,样品经索氏萃取 24 h后,溶剂用旋转蒸发仪减压蒸干,待溶剂充分挥发后再次对平底烧瓶称重并计算土壤中的油含量.采用稀释平板法测定总异养细菌数,采用MPN法[8]测定土壤中石油烃降解菌数.

脱氢酶活性的测定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[9],TTC在脱氢酶作用下会生成红色的三苯基甲臜 (TPF).称取 5 g土样到具塞锥形瓶中,在瓶中加入 5 mL 0.4%TTC溶液.用同种土样的灭菌土5 g,同上加入 TTC溶液作为对照.锥形瓶 37℃避光培养 24 h后加入少量甲醛中止反应,并加入 5 ml丙酮 37℃振荡 10 min,转入离心管 4000 r·min-1离心 5 min,取上清液在 485 nm波长下比色测定TPF生成量.脱氢酶活性大小用每克干土中生成的 TPF量来表征.

1.4 土壤样品总 DNA提取、PCR扩增和变性凝胶梯度电泳 (DGGE)分析

采用 ZR土壤微生物DNA提取试剂盒 (ZY MO RESEARCH,U.S.A),提取土样 DNA.得到土壤DNA样品约为 100μl,于 -20℃保存.

将提取的土样总 DNA作为聚合酶链反应 (PCR)的模板,采用细菌的 16SrRNA的 V3高变区通用引物进行扩增,所用的正向引物是 F357GC:

5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3’,

反向引物 R518:5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’,40个 GC夹加到 F338前面,以保证 DGGE实验的稳定和片断的分离,这一对引物能够扩增绝大多数细菌基因组的V3区.

PCR反应体系包括 2μl模板、2μl的 10μmol·l-1引物、25μl的 2×Long Taq PCR Maste rMix(10 mmol·l-1Tris-HCl,50 mmol·l-1KCl,250μmol·l-1dNTP,1U Taq酶 ·10μl-1), 最后用双蒸水补足至 50μl.

PCR反应程序如下:94℃ 5 min;前 20个循环 94℃ 60 s,65℃—55℃ 60 s,72℃ 3 min(其中每两个循环温度降 1℃),后 10个循环为 94℃ 60 s,55℃ 60 s,72℃ 3 min;最后 72℃ 7 min.

PCR产物进一步用变性梯度凝胶电泳 (DGGE)分离.凝胶变性梯度为 30%—60%.电泳缓冲液1×TAE,60℃,200V电泳 3—4 h.电泳结束后将凝胶进行银染,用凝胶成像分析系统拍照,Quantity One软件分析.

2 结果与讨论

2.1 供试土壤的含油量及理化性质

经实验测得,供试土壤的初始含油量高达 8.46%(即 84600 mg·kg-1),远远高于国家农业标准临界值 500 mg·kg-1[10].由表1可以看出,由于供试土壤含油量很高,因此土壤中有机碳含量相应也很高.研究表明,土壤环境中的营养元素 C和 N和 P之间的质量比一般要达到 100∶10∶1时才能最好地满足微生物生长,促进污染物的降解[11].供试土壤中生物可利用的 N和 P与微生物降解所需最佳 C,N和 P比例相比严重不足,因此选择NPK复合肥作为营养助剂的主要部分,通过调节土壤的N和 P比例来满足土壤中微生物的营养需求,增强土壤微生物活性、促进石油烃的降解.

2.2 修复实验过程中土壤含油量变化

经过 60d的修复实验,各处理组含油量的变化情况见图1.从图1可以看出,4个处理的土壤含油量在 60d的修复实验中有着不同程度的降低.对照 CK第 60d时石油烃降解率为 3.5%,这是土著微生物的降解和石油烃挥发所致.另外实验过程中定期翻土保持好氧并补充水分,也起到刺激微生物生长的作用[12,13].添加了NPK复合肥的处理相比于对照石油烃降解率高出约 28%(F处理 60d降解率为 31.3%),通过调节土壤中 C/N的比例明显起到了促进土著微生物降解石油烃的效果.

图1 不同处理土壤中含油量随时间变化●CK,▲F,◇FL,◆FHFig.1 Oil content changes in soilswith different treatments as a function of time

在用NPK肥调节 C/N比的基础上,添加 5%,10%的腐殖酸-诺沃肥分别将降解率提高到了39.5%和 37.9%.由于添加营养助剂的三个处理具有相同的 C/N比 (C/N为 10∶1),诺沃肥-腐殖酸能更好地促进土壤石油烃降解的原因可能有:(1)诺沃肥是酶制剂发酵生产的废弃物,本身含有大量容易被微生物利用的有机物,更能够刺激土著微生物的生长.有研究表明除添加 N和 P等营养元素外,加入一些其它碳源底物 (co-substrates)如:市政下水道污泥、石油精炼厂污泥、葵花籽油、活性污泥等会对生物修复速率产生积极的影响[14]. (2)腐殖酸是植物死亡后在微生物与化学作用下形成的一种比较稳定的天然大分子有机质,作为肥料腐殖酸除提供氮磷等营养物质之外,还能吸附、交换和活化土壤中很多矿质营养元素,如磷、钾、钙、镁、铁、硫以及微量元素等,使这些元素的有效性大大增加.另外腐殖酸分子内含有多种活性官能团,具有亲水性、吸附性和络合性,因而又可以充当天然表面活性剂促进土壤中有机污染物的淋溶[15],已有研究将腐殖酸应用到石油污染土壤的修复之中,并起到一定的效果[16].由于诺沃肥和腐殖酸本身成分构成的复杂性,以上两条原因还有待实验的进一步考证.不同添加量(5%,10%)对石油烃降解率没有明显的差别,在实际修复工作中由于经济因素和可操作性,大于 10%的浓度无法在实践中进行,因而本研究中没有考虑设置更高的浓度梯度.

2.3 修复实验过程中土壤微生物数目的变化

表2列出 60d修复实验中,各处理土壤总异养菌数和石油烃降解菌数的变化情况.从表2可以看出,对照在 60d的实验中总异养菌数始终较低 (105—106CFU·g-1),添加营养助剂的三个处理总异养菌数明显高于对照 (高 1—2个数量级).这说明调节 C/N比确实起到了刺激土著微生物生长的效果.

不同处理组之间比较,施加诺沃肥-腐殖酸 5%(FL),10%(FH)的处理在第 7天时总异养菌数要高于 F处理.但在随后的时间里,各处理总异养菌数相差不大.这可能是因为腐殖酸-诺沃肥中丰富的有机营养物质及高含量的氮磷钾营养元素在短期内刺激土著菌大量繁殖,从而使石油烃的降解率在修复前期就显示出较强优势.但 5%与 10%不同处理之间,总异养菌数没有明显的差别.

所有处理在修复前期 (前 30d内)总异养菌数目较高,随后逐渐降低,与含油率下降先快后慢的变化趋势相一致.开始时营养助剂充足,营养比例较为均衡,微生物生长迅速,石油烃降解速率快.随着营养助剂的消耗,导致 C,N,P等营养比例失衡,石油烃降解速率变缓.因此,在实际修复工作中,相比于一次性添加营养助剂,多次定期添加应能达到更好的修复效果.修复过程中营养元素形态变化 (如氨态氮的增加)和微生物代谢过程中有毒物质的积累也可抑制细菌的生长[6].

表2 不同处理土壤中总异养菌数和石油烃降解菌数的变化Table 2 Change of heterotrophic bacteria number and hydrocarbon degrader number in soilswith different treatments

各个处理土壤中石油烃降解菌数的变化总体趋势与总异养菌数变化一致.表3列出了各个处理土壤中石油烃降解菌数占总异养菌数的比例变化.可以看到添加诺沃肥-腐殖酸的处理石油烃降解菌数所占比例要高于 F处理 (高 10% ±5%),这表明诺沃肥-腐殖酸中的某些成分可诱导石油烃降解菌的生长,进一步导致土壤微生物群落结构发生变化.值得注意的是原始土壤中石油烃降解菌数 (4.7×106MPN·g-1)和石油烃降解菌的比例 (84.7%)已达到相当高的水平.研究表明[17],当土壤中内源性烃降解菌高于 106CFU·g-1时,土壤中石油类污染物自身降解速度会较快,因此在这种石油烃降解菌数比较可观的土壤中投加营养助剂进行生物刺激就可以起到良好的修复效果.

表3 不同处理土壤中石油烃降解菌数占总异养菌数的比例变化Table 3 Ratio of hydrocarbon degrader number to heterotrophic bacteria number in different treatment soils

2.4 修复实验过程中土壤脱氢酶活性的变化

土壤脱氢酶活性也是反映微生物降解石油烃效率的重要指标[18].如图2所示,添加营养助剂使得脱氢酶活性相比于对照显著提高了 3—4倍.但由于土壤样品的不均匀性平行样之间的测量值误差较大,NPK肥单独添加与复合添加的处理之间未发现显著差异.结果表明,土壤脱氢酶活性、细菌数目与除油率的变化趋势呈现明显正相关性,能及时反映土壤微生物降解石油污染物的状态,是可用于实时监测生物修复过程的敏感性指标.

2.5 修复实验过程中土壤微生物种群多样性的变化

本研究采用 PCR-DGGE技术对不同处理土壤在 7d和 24d时所得样品进行微生物种群多样性分析,DGGE指纹图谱见图3,其中左图为凝胶相片,右图为用 Quantity One处理得到的谱带注解图 (图中CK为对照;编号 1,2,3依次为 F,FL和 FH三个处理 7d时的样品;编号 4,5,6分别为 F,FL和FH处理 24d时的样品).

根据DGGE对DNA的分离原理,图谱上的条带信息即可初步反映不同土壤的微生物种群多样性及其构成.由于凝胶相片的技术问题,图3的注解图中不包括空白土样的谱带.由图3胶片可以看出,石油污染抑制了土壤微生物种群多样性,而营养助剂的添加起到了一定恢复作用,表现为谱带数目的增加.生物修复还提高了菌群的密度表现为谱带亮度的提高.

图3表明,种群多样性按 FH-24d(100%)>FL-24d(91.5%)>F-24d(36.6%)>FH-7d(32.6%)>FL-7d(24.4%)>F-7d(8.9%)依次递减.相比于 NPK肥单独添加,诺沃肥-腐殖酸和NPK肥复合添加能更好地提高土壤微生物多样性 (约为 3倍).从不同时间来看,7d时谱带数目都要少于 24d时相应处理的谱带数目 (约 3—4倍),表明修复前期土壤微生物的群落构成变化最为频繁.结合上述细菌数目、土壤脱氢酶活性指标,土壤微生物群落结构在 30d左右趋于稳定.

图2 不同处理土壤中脱氢酶活性随时间的变化●CK,▲F,◇FL,◆FHFig.2 Dehydrogenase activity in different treatment soils as a function of time

图3 不同处理土样 DGGE分离图谱及示意图Fig.3 DGGE profile of different treatment soils

3 结论

在实验室条件下,考察了 NPK复合肥单独添加、5%(W/W)诺沃肥-腐殖酸 (1∶1)与 NPK复合肥复合添加,以及 10%(W/W)诺沃肥-腐殖酸 (1∶1)与 NPK复合肥复合添加对土壤含油率、微生物菌群(数目和多样性)以及土壤脱氢酶活性的影响.营养助剂的添加可显著促进土壤中石油烃的降解.营养助剂添加方式之间,诺沃肥-腐殖酸与 NPK复合肥复合添加对石油烃的降解率要高于 NPK复合肥单独添加 (高 8%左右),其原因可能是诺沃肥-腐殖酸可在短期内提高土著微生物的活性,增加土壤中微生物的多样性,增强石油烃的降解.诺沃肥-腐殖酸的两个添加梯度 (5%和 10%)在本研究中未见明显差别.三种营养助剂添加方式均能够显著提高土壤中总异养菌数、石油烃降解菌数、脱氢酶活性和微生物多样性,且这 4个指标与土壤含油率变化呈正相关.

[1] Ding K Q,Luo YM,Sun T H et al., Bioremediation of Soil Contaminated with Petroleum Using Forced-Aeration Composting[J].Pedosphere,2002,12(2) ∶145—150

[2] 刘五星,骆永明,滕应等,石油污染土壤的生物修复研究进展 [J].土壤,2006,38(5)∶634—639

[3] Molina-Barahona L,Rodriguez-Vazquez R,Hernandez-VelascoM et al.,Diesel Removal from Contaminated Soils byBiostimulation and Supplementation with Crop Residues[J].Applied soil Ecology,2004,27(2) ∶165—175

[4] Gallego J L R,Lorego J,Llamas J F et al.,Bioremediation ofDiesel-Contaminated Soils∶Evaluation of Potential in Situ Techniques by Study ofBacterialDegradation[J].B iodegradation,2001,12(5) ∶325—335

[5] WellmanD E,UleryA L,BarcellonaM P et al.,AnimalWaste-EnhancedDegradation ofHydrocarbon-Contaminated Soil[J].Soil and Sediment Contam ination,2001,10(5) ∶511—523

[6] SarkarD,FergusonM,Datta R et al.,Bioremediation of Petroleum Hydrocarbons in Contaminated Soils:Comparison ofBiosolidsAddition,Carbon Supplementation,andMonitored NaturalAttenuation[J].Environmental Pollution,2005,136(1) ∶187—195

[7] Lee S,Oh B,Kim J,Effect ofVariousAmendments on HeavyMineralOilBioremediation and SoilMicrobialActivity[J].B ioresource Technology,2008,99(7) ∶2578—2587

[8] W renn B A,Venosa A D,Selective Enumeration ofAromatic and Aliphatic Hydrocarbon DegradingBacteria by aMost-Probable-Number Procedure[J].Canadian Journal of M icrobiology,1996,42(3) ∶252—258

[9] 张清敏,李洪远,王兰,环境生物学实验技术 [M].北京:化学工业出版社,2005,130—131

[10] 李春荣,王文可,曹玉清等,石油污染物的微生物降解研究 [J].生态环境,2008,17(1)∶113—116

[11] Khaitan S,Kalainesan S,Erickson L E et al.,Remediation of Sites Contaminated byOil RefineryOperations[J].Environmental Progress,2006,25(1) ∶20—31

[12] Dibble J T,Bartha R,Effect of Environmental Parameters on the Biodegradation of Oil Sludge[J].Applied and Environmental M icrobiology,1979,37(4) ∶729—739

[13] 杨乐巍,李鑫钢,黄国强等,生物通风体系中的土壤环境研究及微生物分析 [J].环境化学,2007,26(4)∶479—482

[14] Mohan SV,Kisa T,Ohkuma T et al.,Bioremediation Technologies for Treatment of PAH-Contaminated Soil and Strategies to Enhance Process Efficiency[J].Reviews in Environmental Science and B iotechnology,2006,5(4) ∶347—374

[15] Conte P,Agretto A,Spaccini R et al.,Soil Remediation:Humic Acids asNatural Surfactants in the Washings of Highly Contaminated Soils[J].Environmental Pollution,2005,135(3) ∶515—522

[16] 练湘津,刘云国,曾光明等,腐殖酸做表面活性剂对加油站油污土壤的修复 [J].石油化工高等学校学报,2006,19(3)∶23—26

[17] Forsyth J V,Tsao YM,Bleam R D,Bioremediation: when isAugmentationNeeded?[M].Columbus∶Battelle Press,1995,1—14

[18] 胡晓芳,夏福军,朱南文等,原油污染土壤的生物法修复效果研究 [J].环境化学,2006,25(5)∶593—597

BI OREM ED IATI ON OF PETROLEUM CONTAM INATED SO I L BY VARI OUS NUTRIENT AM ENDM ENTS

Q IAO Jun CHEN W ei ZHANG Cheng-dong
(College of Environmental Science and Engineering,NankaiUniversity,Tianjin KeyLaboratory of Environmental Remediation and Pollution Control,KeyLaboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria atMinistry of Education,Tianjin,300071,China)

Under laboratory conditions,NPK fertilizer,NovoGro and humic acid were added to petroleum contaminated soil in differentproportions and their effectson bioremediation were evaluated.During the 60-day experiments,soil sampleswere collected and analyzed periodically to determine the oil content,heterotrophic bacteria number,hydrocarbon degrader number and dehydrogenase activity. In addition,PCR-DGGE was utilized to analyze the change of biodiversity during bioremediation.The results show that microorganism population,dehydrogenase activity and bacterial biodiversitywere significantly enhanced in the treatmentswith NPK fertilizer alone and the combined amendments(including NPK fertilizer,NovoGro and humic acid).After 60 days,the initial oil content(84600 mg·kg-1)was reduced by 31.3%—39.5% in nutrients amended soils,whereas it was only reduced by 3.5% in nonamended soil.Soil with combined amendment showed more efficient degradation than soilwith NPK fertilizer alone(about8%higher).The degradationmay be the results of the significantly enhanced microbial activity and biodiversity which were stimulated by NovoGro and humic acid addition.

petroleum,bioremediation,biostimulation,microbial activity,PCR-DGGE.

2009年5月9日收稿.

＊国家高技术研究发展计划 (863计划)重点项目 (No.2007AA061200);天津市自然科学基金 (No.07JCYBJC16300);教育部留学回国人员科研启动基金资助项目.

＊＊通讯作者,E-mail:zhangchengdong@nankai.edu.cn