二茂铁-肽Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe的合成及其与Cu(II)作用

刘晓芳 李学强 叶武龙 周彬彬 刘又年

(中南大学化学化工学院,长沙 410083)

二茂铁-肽Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe的合成及其与Cu(II)作用

刘晓芳 李学强 叶武龙 周彬彬 刘又年*

(中南大学化学化工学院,长沙 410083)

以二茂铁甲酸、甘氨酸(H-Gly-OMe)、脯氨酸(Boc-Pro-OH)、精氨酸(H-Arg(NO2)-OMe)等为原料,苯并三唑-1-四甲基六磷酸酯(HBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBT)为缩合剂,采用液相法合成了二茂铁-肽Fc-Gly-Pro-Arg (NO2)-OMe(简称Fc-GPR),其总收率为48.1%.并对目标产物进行了红外(IR)光谱、核磁共振氢谱(1H-NMR)、质谱(ESI-MS)等表征.通过电化学方法研究了目标产物与Cu(II)之间的相互作用.结果表明:目标产物在溶液中的电化学行为表现为可逆氧化还原反应,氧化和还原峰电位分别为0.624和0.552 V(vs Ag/AgCl),氧化和还原峰电流之比Ipa/Ipc为1.13,电极反应过程为扩散控制.目标产物与Cu(II)形成配位比为2∶1的配合物.Fc-GPR与Cu(II)的电极反应过程符合电化学-化学-电化学(ECE)历程.

二茂铁-肽;液相合成;Gly-Pro-Arg;电化学-化学-电化学历程;铜离子

二茂铁是一种具有一定厚度的夹心结构和芳香性的富电子体系,热稳定性好,电化学氧化还原可逆且易受环境影响.目前二茂铁衍生物的研究越来越引起科学家的兴趣.它具有良好的亲脂性,能顺利通过细胞膜,从而与细胞内的各种酶、DNA等物质作用,它的低毒性、稳定性使其广泛应用于药物研究.例如在青霉素和先锋霉素中引入二茂铁基时可使抗菌活性提高[1].此外,二茂铁衍生物及其配合物具有抗癌[2-3]、抗疟疾[4]、抗炎等生物活性;二茂铁还可标记DNA和多肽[5-6]作为电化学探针,应用于特定序列DNA片段和蛋白的识别和检测等[7-8].

Gly-Pro-Arg(GPR)寡肽是一种能够抑制由β-淀粉样蛋白(β-amyloid peptide,简称Aβ)导致的神经元细胞毒性的活性肽[9],它能减少Aβ对海马神经元的损伤;此外,Furlan等[10-11]发现GPR可以抑制纤维蛋白原的聚集,从而阻止纤维蛋白的形成.但是, GPR对Aβ的抑制机理尚不明确.生物电化学方法具有快速、灵敏、简单的优点,但GPR不具有电化学活性,因此,可以将Fc-GPR作为电化学探针来研究GPR抑制阿尔默海次病(Alzheimer′s disease,简称AD病)的治疗机理.此外,引入疏水性二茂铁基团,可以增加寡肽的稳定性和脂溶性,使其能够顺利地透过血脑屏障而到达给药靶点.

铜是一些酶的重要组成部分,在人体大脑新陈代谢中起着重要的作用,铜离子参与了许多生化反应过程,但是体内过高的Cu(II)浓度能产生毒性[12],如改变细胞内的氧化还原状态,与某些氨基酸残基的侧链发生非特异的反应,导致蛋白质的错误折叠.有文献报道[13-14]铜积累可促进阿尔默海次病患者脑中Aβ聚集而导致老年斑的形成:Aβ可以结合Cu(II),引起氧化损伤[15],导致细胞死亡,这可能是引发AD病的原因之一.此外,Freedman等[16-18]利用电子顺磁共振(EPR)，单晶X射线衍射分析等方法研究了Cu(II)与短肽分子的配位应用.如在中性条件下,三肽Gly-His-Lys(GHK)与Cu(II)形成1∶1的络合物,该络合物具有生物活性,可用于治疗伤口和皮肤的损伤.

多肽分子与金属离子配位作用的研究方法主要有:单晶X射线衍射分析、圆二色(CD)谱、EPR、 NMR、MS等.但是多肽作为配体与金属离子的络合物不易得到单晶,难以用单晶X射线衍射分析.另外,CD、EPR、NMR和MS等方法又存在操作繁琐、仪器昂贵等不足,而电化学方法具有快速、简单、灵敏的特点.将具有电化学活性的二茂铁基引入到多肽中,可以通过电化学方法研究多肽与金属离子的配位和电化学反应机理.在本文中,采用液相合成法合成二茂铁-肽Fc-GPR,利用电化学方法研究该化合物与Cu(II)作用,并对其机理进行探讨.

1 实验

1.1 主要仪器与试剂

AVATAR360傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司),INOVA400核磁共振仪(美国Varian公司),LCQ Advantage离子阱质谱仪(美国菲尼根公司).CHI440电化学工作站(上海辰华仪器有限公).

H-Gly-OMe,Boc-Pro-OH,H-Arg(NO2)-OMe均为分析纯且购自吉尔生化(上海)有限公司;二茂铁甲酸、苯并三唑-1-四甲基六磷酸酯(HBTU)、1-羟基苯并三唑(HOBT)均为分析纯,购自上海生工生物工程技术有限公司;CuCl2·2H2O和四丁基高氯酸胺(TBAP)为色谱纯,购自美国Alfa Aesar公司;二氯甲烷经氢化钙干燥重蒸,甲醇为色谱纯,其它试剂均为分析纯,所有水均为二次蒸馏水.

1.2 目标产物合成

[19-21]报道的合成二茂铁-多肽方法合成目标产物,以二茂铁甲酸为原料,HBTU/ HOBT为缩合剂,采用液相合成的方法得到二茂铁-三肽化合物:Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe.其合成路线如图1所示.

图1 Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe(Fc-GPR)的合成Fig.1 Synthesis of ferrocenoyl-labeled Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe(Fc-GPR)i)N-hydroxybenzotriazole(HOBT)/o-benzotriazol-1-yl-N,N,N′,N′-tetramethyluronium hexafluorophosphate(HBTU),Et3N,CH2Cl2; ii)NaOH;iii)HCl,CH3COOCH2CH3

1.2.1 H-Pro-Arg(NO2)-OMe(2)的合成

称取Boc-Pro-OH(4.0 mmol,0.86 g)溶于无水CH2Cl2,于0℃下缓慢滴入1.5 mL Et3N,并依次加入HBTU(4.4 mmol,1.52 g),HOBT(4.4 mmol,0.60 g),反应1 h后,加入H-Arg(NO2)-OMe(4.0 mmol,1.08 g),0℃恒温反应1 h,移入室温反应,用薄层色谱法(TLC)检测反应进程.待反应完全,依次用10%盐酸,饱和NaHCO3溶液和蒸馏水洗涤;有机相用无水硫酸钠脱水,真空干燥即得粗产物1.59 g,产率为85%.

将化合物Boc-Pro-Arg(NO2)-OMe溶于无水乙酸乙酯,0℃下缓慢通入干燥的HCl气体搅拌反应1 h,移入室温反应1 h后,真空干燥,除去过量HCl气体,得产物H-Pro-Arg(NO2)-OMe(2).

1.2.2 二茂铁-甘氨酸及目标产物(Fc-GPR)的合成

(1)化合物Fc-Gly-OH(4)的合成

称取化合物3(5.65 mmol,1.3 g)溶于无水CH2Cl2,冰浴下搅拌缓慢滴加2.0 mL Et3N,再依次加入HBTU (6.19 mmol,2.4 g),HOBT(6.19 mmol,0.84 g),反应1 h后,加入H-Gly-OMe(8.02 mmol,1.00 g),0℃恒温反应1 h;移入室温反应,用TLC检测反应.待反应完全,依次用10%盐酸,饱和NaHCO3溶液,蒸馏水洗涤;有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,真空干燥,柱层析法纯化[展开剂V(CH2Cl2)∶V(CH3COOC2H5)= 2∶1],即可得化合物Fc-GlyOMe 1.56 g.

将1.56 g Fc-GlyOMe溶于50 mL四氢呋喃,用少量的蒸馏水溶解0.18 g NaOH,加入反应液中冰浴下反应0.5 h,移入室温下反应12 h;反应结束后将反应液蒸干,加水50 mL,用乙酸乙酯洗三次,取水相用体积比为1∶1的HCl调节pH为1-2,再用乙酸乙酯洗三次,取油相,无水硫酸钠干燥,抽滤蒸干后即得产物(4)1.04 g,产率为78%.

(2)Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe的合成

称取二茂铁-甘氨酸(3.614 mmol,1.04 g)溶于无水CH2Cl2,0℃下缓慢滴入1.5 mL Et3N,依次加入HBTU(3.975 mmol,1.51 g),HOBT(3.975 mmol,0.54 g),反应1 h后,加入化合物4(3.4 mmol,1.45 g),0℃恒温反应1 h,移入室温反应,用TLC检测反应进程.待反应完全,依次用10%盐酸、饱和NaHCO3溶液、蒸馏水洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,真空干燥即可得粗产物1.73 g.用柱层析法[展开剂的体积比为V(CH2Cl2)∶V(CH3COOC2H5)∶V(CH3OH)=90∶30∶5,Rf=0.37]进行纯化,真空干燥,得到产物1.60 g.总收率为48.1%.IR(cm-1):1105,824 cm-1(ν(Fc)); 1740 cm-1(ν(C═O));3307 cm-1(ν(N—H));1438 cm-1(ν(C—N));1539 cm-1(δ(N—H));1629 cm-1(ν(C═N Arg)).1H-NMR(CDCl3,δ):8.206(s,H,HNCO,Arg), 7.38(s,H,H—N,Gly),7.021(s,H,NHC═NH,Arg), 4.627(quint,H,CH,Arg),4.398(s,2H,H-2′,H-5′,Fc), 4.351(s,2H,H-3′,H-4′,Fc),4.215(s,2H,Gly),3.792 (s,3H,OCH3,Arg),3.241(s,5H,Fcunsubst).ESI-MS,m/z: 622.6[M+Na]+.

1.2.3 Boc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe的合成

称取Boc-Gly-OH(4.0 mmol,0.69 g)溶于无水CH2Cl2.0℃下缓慢滴入1.5 mL Et3N,依次加入HBTU (4.4 mmol,1.52 g),HOBT(4.4 mmol,0.6 g),反应1 h后,加入化合物2(3.0 mmol,1.40 g),0℃恒温反应1 h,移入室温反应,用TLC检测反应 [展开剂体积之比V(CH2Cl2)∶V(CH3COOC2H5)∶V(CH3OH)=90∶30∶3],待反应完全.依次用10%盐酸、饱和NaHCO3溶液、蒸馏水洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥,过滤,真空干燥即可得粗产物1.73 g.用柱层析法对粗产物进行纯化,展开剂体积之比为V(CH2Cl2)∶V(CH3COOC2H5)∶V(CH3OH)=90∶30∶5,Rf=0.42.真空干燥,得到产物(GPR)1.60 g.总收率为56.1%(对Boc-Gly-OH).FT-IR(KBr,cm-1):742 cm-1(ν(C═O,—COOCH3));3309 cm-1(ν(N—H));1453 cm-1(ν(C—N));1537 cm-1(δ(N—H));1644 cm-1(ν(C═N)),1255 (ν(NO2)).1H-NMR(CDCl3,δ):8.420(s,1H,HNCO, Arg),7.762(s,H—N,Gly),7.211,6.13(s,1H,NHC═NH,Arg),7.271(s,1H,CDCl3),4.625(sxt,2H,CH, Arg),3.76 7(s,3H,OCH3,Arg),3.357,3.251(s,2H, CH2,Pro),3.523,3.492 (s,2H,CH2,Gly),1.435(s, 9H,Boc).

1.2.4 电化学实验

将配好的4 mmol·L-1的Fc-GPR溶液中移取0.75 mL加入10 mL的培养皿中,再用移液管移取不同配比的CuCl2的甲醇溶液,摇匀反应过夜.12 h后用移液管加入0.3 mL配好的1 mol·L-1的TBAP溶液作为支持电解质,再加入一定量的甲醇,使得测量体系的溶剂的总体积为6 mL,轻微晃动至均匀,避光静置过夜,室温下进行电化学测试,以玻碳电极为工作电极,Ag/AgCl电极为参比电极,铂丝(Pt)电极为对电极,支持电解质为0.05 mol·L-1的TBAP,扫描速率为100 mV·s-1,每次测定前电解池通入10 min氮气除氧.

2 结果与讨论

2.1 化合物的表征

二茂铁基团上的质子化学位移一般在4-5之间,目标化合物在化学位移4.351-4.40之间出现被取代的环戊二烯环上的4个质子峰,3.24出现另外一个茂环上的5个质子峰.4.627可指认为精氨酸次甲基上的1个质子峰,化学位移为7.02的峰可指认为精氨酸胍基上的质子峰,胍基上的另外两个质子峰未能观察到,可能是胍基上的两个质子与硝基形成六元环的分子内氢键,而化学位移7.38的单峰可指认为二茂铁甲酸与甘氨酸所结合酰氨键上氨基的质子峰,化学位移为8.21的单峰可指认为精氨酸酰胺键上的1个质子峰.亚甲基的化学位移一般在2-4之间出现.

2.2 电化学性质

通过循环伏安(CV)方法对目标产物Fc-GPR进行电化学性能测试,结果如图2所示.当扫描速率为100 mV·s-1时,在0.4-0.8 V范围内出现了一对可逆性较好的氧化还原峰,氧化峰和还原峰电位分别为0.624和0.552 V,峰电位差为△Ep=72 mV,峰电流之比ipa/ipc=1.13,表明Fc-GPR在溶液中的良好的电子传递能力.当改变扫描速率,发现其峰电流随扫描速率的增加而增加,且峰电流和扫描速率的平方根成正比例关系,说明该电极反应步骤受扩散控制.

2.3 目标产物与铜离子络合的电化学性质

根据经典的测定络合物配比的摩尔比列法[22],即通过固定溶液中Fc-GPR的浓度,改变Cu(II)的浓度,根据二茂铁阳极峰电流发生改变的情况计算出Cu(II)与Fc-GPR的配位比.如图3所示,曲线转折点m对应的摩尔浓度比c(FcGPR)/c(Cu2+)=2∶1,即 Fc-GPR与Cu(II)形成配合物[Cu(Fc-GPR)2]Cl2.

图2 Fc-GPR的循环伏安图Fig.2 Cyclic voltammogram of Fc-GPRscan rate:100 mV·s-1

由图4可知:当c(Fc-GPR)/c(Cu2+)=1∶2时,电对Cu(II)/Cu(I)的峰电位差随着扫描速率的增加而增大,表明Cu(I)离子在配位环境中比游离的Cu(I)能够更稳定地存在,主要是因为Cu(I)离子在配位环境中的电化学过程发生了重排,则相对较高的还原电位表明Cu(I)在FcGPR的配位作用下更稳定[23].

图5 0.5 mmol·L-1Fc-GPR与0.5 mmol·L-1Cu2+溶液的循环伏安(CV)图Fig.5 Cyclic voltammogram of Fc-GPR (0.5 mmol·L-1)with Cu2+(0.5 mmol·L-1)

2.4 ECE偶合反应机理

如图5所示目标产物(Fc-GPR)与Cu(II)的作用是一个单电子两步反应,根据ECE[24-27]反应机理,其电化学过程[28-30]为:

图6 不同浓度GPR与Cu(II)作用的微分脉冲伏安图Fig.6 Differential pulse voltammogram on carbon electrode of Cu(II)with GPRc(Cu2+)=0.5 mmol·L-1;c(GPR)/(mmol·L-1):a)0,b)0.5,c)1.0

对于两步单电子反应,△E比-(RT/nF)ln2=-35.6 mV正时,表示正相互作用(即第二步电子转移受到第一步反应的促进);△E比-(RT/nF)ln2=-35.6 mV负时,表示负相互作用.当c(Fc-GPR/c(Cu2+)=1∶1时,△E=E2-E1=0.3395 V-0.5885 V=-249 mV＜-35.6 mV,可以明显观察到此时CV图有两个波形[29-30].因此,当Fc-GPR的量不变,加入的铜离子的量增加时,溶液中游离的Fc-GPR的量减少,使得反应(1)难发生,二茂铁的氧化还原反应受到抑制,使得其峰电流减小直到消失(见图5).此外,随着铜离子的量增加,铜离子的阳极峰电位正移动.实验结果证实该电化学反应过程符合ECE反应机理.而另一方面,单独的GPR与铜离子作用,其电化学信号无明显变化,峰电位基本不变(如图6所示).说明二茂铁基团具有良好的电化学活性,GPR三肽与Cu(II)作用可以通过其电化学性质的变化而得到.

3 结论

(1)以二茂铁甲酸、H-Gly-OMe、Boc-Pro-OH、HArg(NO2)-OMe为原料,合成了一种目前尚未报道的新的化合物Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe.经IR、1HNMR和MS表征确定其结构;利用循环伏安研究了该化合物在甲醇溶液中的电化学性质.

(2)利用循环伏安法和微分脉冲伏安法研究了Fc-GPR,GPR与铜离子的作用,采用摩尔比列法，得到Fc-GPR与Cu(II)的配位比为2∶1.当Fc-GPR与Cu(II)络合物的循环伏安图是一个典型的双波图,其电化学反应过程符合偶合均相电化学反应的ECE机理.

(3)将具有良好氧化还原活性的二茂铁基团标记三肽GPR,为研究金属离子与多肽的相互作用机制提供了一种新的方法.目前,我们正将Fc-GPR作为电化学探针,研究Cu(II)与Aβ的相互作用机制;并将其作为螯合肽与人体内过量铜离子结合,抑制因过量铜离子引起的Aβ聚集,从而达到治疗阿尔茨海默病的目的.

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Synthesis of Ferrocenoyl-Labeled Tripeptide Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe and Its Interaction with Cu(II)

LIU Xiao-Fang LI Xue-Qiang YE Wu-Long ZHOU Bin-Bin LIU You-Nian*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Central South University,Changsha 410083,P.R.China)

N-ferrocenoyl-labeled tripeptide Fc-Gly-Pro-Arg(NO2)-OMe(Fc-GPR)was synthesized from ferrocenecarboxylic acid,glycine(H-Gly-OMe),proline(Boc-Pro-OH)and arginine(H-Arg(NO2)-OMe)by solution synthesis with a yield of 48.1%.The synthesized Fc-GPR was characterized by infrared spectroscopy(IR),proton nuclear magnetic resonance spectroscopy(1H-NMR)and electrospray ionization mass spectroscopy(ESI-MS).The electrochemical behavior of Fc-GPR was investigated using electrochemical methods.We observed a pair of well-defined voltammetric peaks with cathodic Epcand anodic peak potentials Epa,at 0.552 and 0.624 V(vs Ag/AgCl),respectively.The ratio of oxidative to reductive peak current is 1.13 and the peak currents were found to be proportional to the square root of the scan rates suggesting that Fc-GPR undergoes a reversible electron transferreaction.The molarratio of Fc-GPR to Cu(II)was found to be 2:1 by the molar ratio method.Furthermore,the electrode reaction of Fc-GPR with Cu(II)is an electrochemicalchemical-electrochemical(ECE)process.

Ferrocene-peptide;Solution synthesis;Gly-Pro-Arg;Electrochemical-chemical-electrochemical process;Cu(II)

O641

Received:March 9,2010;Revised:April 18,2010;Published on Web:June 25,2010.

*Corresponding author.Email:liuyoun@mail.csu.edu.cn;Tel:+86-731-88836964.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20876179).

国家自然科学基金(20876179)资助项目

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