多元线性回归设计玉米须β-谷甾醇的提取

赵文竹,于志鹏,于一丁,刘静波

(吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室,吉林长春 130062)

多元线性回归设计玉米须β-谷甾醇的提取

赵文竹,于志鹏,于一丁,刘静波＊

(吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室,吉林长春 130062)

建立了玉米须β-谷甾醇测定方法及热回流提取的多元线性回归模型,实验分别考察了提取温度、时间、液固比及乙醇浓度对β-谷甾醇含量的影响,并通过多元线性回归设计了热回流提取模型。结果表明,β-谷甾醇测定方法准确可靠,可以用于玉米须中的β-谷甾醇的测定。同时乙醇提取玉米须β-谷甾醇多元线性回归模型显著,不失拟。玉米须β-谷甾醇的最佳工艺参数为提取温度 45℃、时间 80min、液固比 25∶1、乙醇浓度 75%,其中β-谷甾醇的提取率可达1.52%。

玉米须β-谷甾醇,紫外检测,热回流提取,多元线性回归设计

1 材料与方法

1.1 材料与设备

玉米须 分别采摘自吉林省九台、四平、德惠地区,由吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室提供;硼酸 (H3BO3)、甲基红-溴甲酚绿混合指示剂、氢氧化钠、乙酸锌、亚铁氰化钾、乙醇、氯仿等分析纯试剂,北京化工厂;葡萄糖 (Glc)标准品 美国SIG MA公司。

表1 因素编码表

F W-200高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司;CS-501超级恒温水浴锅 上海东荣丰科仪器有限公司;752-PC紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;QSY凯氏定氮仪 北京强盛分析设备有限公司;ZF-06脂肪测定仪 上海瑞正仪器设备有限公司;DZF-6050远红外干燥箱 上海博迅实业有限公司;AG204分析天平 瑞士METT LER T OLEDO。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米须营养成分分析 蛋白质的测定：微量凯氏定氮法《GB/T 5009.5-2003》;还原糖的测定：直接滴定法《GB/T5009.7-1985》;脂肪的测定：索氏提取法《GB/T 5009.6-2003》;水分的测定：直接称量法《GB/T 10362-1989》;灰分的测定：高温炉炭化法《GB/T 12086-1989》。

1.2.2 β-谷甾醇标准曲线的建立

1.2.2.1 β-谷甾醇标准液的配制 精密称取 18mg β-谷甾醇标准样品,用氯仿定容到 10mL为对照液(浓度为 1.8mg/mL)。用刻度移液管分别准确量取对照液 0、0.3、0.5、1、1.2、1.5、2、2.5mL于 5mL容量瓶中,浓度分别是 0、0.108、0.18、0.36、0.43、0.54、0.72、0.9mg/mL加氯仿至刻度,摇匀。

1.2.2.2 β-谷甾醇标准曲线建立 将对照液以氯仿为空白,在200～400nm波长范围内每隔10nm测定一次吸光值。根据测定实验数据,以波长为横坐标,以吸光度值为纵坐标绘制扫描图。在最大吸收波长下测定标准品的吸光值,以吸光值为纵坐标,以浓度为横坐标,绘制β-谷甾醇标准曲线。

1.2.3 玉米须β-谷甾醇检测方法的验证实验

1.2.3.1 精密度实验 取浓度为 0.54mg/mL的标准溶液,经 6次取样后在 243nm处测其吸光度值,考察测定所得结果之间接近的程度。

1.2.3.2 重现性实验 取九台地区玉米须原料 (过60目筛)5g,精密称定,按供试品溶液制备方法平行制备样品供试液6份,浓缩后用氯仿定容至5mL。各取 3mL,在243nm处测定吸光度。

1.2.3.3 稳定性实验 取处理好的九台地区玉米须样品溶液 3mL,于 243nm波长下进行测定,分别考察了 1、2、3、4、5、6h玉米须提取液β-谷甾醇的含量,从而考察了测定方法的稳定性。

1.2.3.4 回收率实验 精密吸取 0.8mL浓度为0.43mg/mL的β-谷甾醇对照品溶液 6份,分别加入6份已知β-谷甾醇吸光度为 0.187,即β-谷甾醇粗提物的含量为 1.25%的九台地区玉米须提取液,在243nm处测定吸光度,根据回归方程计算回收率。

1.2.4 热回流法提取β-谷甾醇 实验采用多元线性回归设计热回流提取九台地区玉米须β-谷甾醇,分别考察乙醇浓度、提取时间、料液比、提取温度四个因素,每个因素平行测定三次。

1.2.4.1 温度对β-谷甾醇含量的影响 在液固比为20∶1,提取时间为 90min,颗粒度为 60目,及 75%浓度乙醇时,对比分析在 40、50、60、70、80、90℃六个温度条件下的甾醇物质含量,以确定最佳的提取温度。

1.2.4.2 时间对β-谷甾醇含量的影响 选择液固比为 20∶1,颗粒度为 60目,提取温度为 50℃及 75%乙醇浓度的条件下,对比分析 30、60、90、120、150、180min六个不同提取时间实验条件下甾醇的含量,以确定最佳的提取时间。

1.2.4.3 液固比对β-谷甾醇含量的影响 选择颗粒度为60目及75%的乙醇浓度、时间一定的条件下,对比分析液固比为 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1六个实验条件下玉米须甾醇含量,以确定适宜的液固比。

1.2.4.4 乙醇浓度对β-谷甾醇含量的影响 选择液固比为 20∶1,颗粒度为 60目,提取温度为 50℃,提取时间 90min,对比分析了 45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇浓度对玉米须甾醇类物质含量的影响,以确定最优乙醇浓度。

1.2.5 多元线性回归模型建立[14]通过上述单因素实验优化出最优提取条件,为了进一步考察β-谷甾醇含量与提取温度、提取时间、液固比、乙醇浓度的关系,拟采用多元线性回归设计方法求其定量关系,各因素实验考察的范围是：z1：40～60℃,z2：80～100min, z3：20∶1～40∶1,z4：75%～95%。

2 结果与讨论

2.1 玉米须中基本营养成分的测定结果分析

表 2 三个产地玉米须中基本营养成分的含量

玉米须β-谷甾醇主要存在油脂中,通过营养素成分测定可知,九台、四平、德惠地区的玉米须脂肪含量分别为 1.64%、1.03%、0.59%,九台和德惠地区玉米须脂肪含量具有明显差异性,这表明玉米须中各营养成分的含量多少与其产地有关。实验选择九台地区玉米须作为实验原料,考察β-谷甾醇的提取工艺。

2.2 最大吸收波长的确定

玉米须提取液经浓缩后,用氯仿定容至 10mL的容量瓶,以氯仿为空白液,在 200～400nm波长范围内经紫外分光光计每隔 10nm测定一次吸光值,以波长为横坐标,以吸光值为纵坐标绘制扫描图。标准品最大吸收波长测定方法与样品液测定方法相同。如图 1、图 2所示,β-谷甾醇标准品与玉米须提取液均在 243nm处有最大吸收峰,这表明玉米须提取液中存在β-谷甾醇,并且最大吸收峰为 243nm。

图1 β-谷甾醇标准品扫描图

图2 β-谷甾醇提取液扫描图

2.3 标准曲线的绘制

分别取浓度为 0、0.108、0.18、0.36、0.43、0.54、0.72、0.9、1.8mg/mL的β-谷甾醇对照品在 243nm处测吸光度,以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,如图 3所示。得回归方程 y=0.5378x-0.0017,R2=0.9934,标准曲线的线性关系良好。

图3 β-谷甾醇标准曲线

2.4 玉米须β-谷甾醇测定方法学验证

根据上述实验方法,对玉米须β-谷甾醇检测方法进行精密度、重现性和稳定性及回收率的测定,如表 3可知,β-谷甾醇测定方法的精密度高,重现性良好,稳定性较高,回收率的相对标准偏差符合实验要求。

2.5 玉米须β-谷甾醇的提取

2.5.1 提取温度对β-谷甾醇含量的影响 提取温度为横坐标,β-谷甾醇的含量为纵坐标,得到提取温度与β-谷甾醇含量变化的关系曲线,由图4可知,随着提取温度的升高,甾醇的提取含量增大,当温度升到 50℃时,甾醇提取含量达到最大值,随着温度的增加,甾醇的提取含量逐渐下降,可能是由于温度过高时导致甾醇的环戊烷并多菲结构破坏,因此在以氯仿为溶剂,以 243nm为检测波长在紫外区进行检测时,含量减少。

表 3 玉米须β-谷甾醇方法学验证

图 4 提取温度对β-谷甾醇含量的影响

2.5.2 提取时间对β-谷甾醇含量的影响 β-谷甾醇的含量与提取时间的关系由图 5可知,是逐渐升高后又逐渐降低的过程,在提取温度控制在 50℃时,提取时间为 90min,甾醇的含量最大,低于 90min,提取不完全,高于 90min,部分甾醇将有可能被破坏,原因可能是当提取时间过长时产生过高温度,使甾醇活性成分湿热降解或异构化,导致提取物有效成分含量降低,因此提取时间以 90min为宜。

图 5 提取时间对β-谷甾醇含量的影响

2.5.3 液固比对β-谷甾醇类物质含量的影响 固定样品量,改变提取溶剂量,由图 6知,在一定范围内,提取溶剂量越大,即液固比越大,甾醇含量就越高。当液固比为 30∶1时,可以把大部分甾醇提取出来,随着液固比的继续增大,提取量提高不明显。为节约成本减少回收溶剂带来的困难,选择液固比为30∶1为宜。

图 6 液固比对β-谷甾醇含量的影响

2.5.4 乙醇浓度对β-谷甾醇含量的影响 乙醇作为玉米须β-谷甾醇的提取溶剂,浓度的大小决定了溶液极性的高低。由图 7知,随着乙醇浓度的增大,甾醇的提取含量逐渐变大,当乙醇浓度大于 75%时,甾醇的提取含量变化缓慢,但仍保持上升趋势,因此选择85%的乙醇浓度为最优提取条件。且在85%的乙醇提取条件下,一些水溶性的极性成分,如蛋白质、果胶、树胶、多糖类等溶解度变小,使其从提取液中沉淀出来,利于有效成分的富集。由于 100%的乙醇与石油醚互溶,因此未以 100%的乙醇作为提取剂。

表4 多元线性回归方案及计算表

图 7 乙醇浓度对β-谷甾醇含量的影响

2.5.5 回归模型的验证 在单因素所确定的最佳参数范围的基础上,以β-谷甾醇含量作为考察的指标,利用多元线性回归设计优化参数,实验结果如表4。对所得到的热回流法提取β-谷甾醇含量的多元线性回归设计进行三项统计检验。

2.5.5.1 回归系数检验 各因素及交互作用的回归系数统计量 Fj及显著性水平见表 4所示,通过最小二乘法求回归系数可知,回归方程的各项系数分别为 b0=0.97,b1=-0.06,b2=0.05,b3=0.01,b4= -0.27,交互作用相的系数为 b12=-0.10,由回归系数检验可知,提取温度、提取时间、液固比均为不显著因素,乙醇浓度为显著性因素,显著性水平为 0.05,提取温度和提取时间的交互作用为显著性因素,显著水平为 0.25。

2.5.5.2 回归方程的显著性检验 对 Fj＜1的项不进行检验,直接从回归方程中剔除,根据本实验中x1x2交互作用项的系数 b12的显著性水平为 0.25,考虑到 Fj更接近于 F0.25(1,2)=2.57,因此将其剔除。所得到的回归方程如式 Y=0.97-0.27x4,回归偏差平方和 S回=0.686,剩余偏差平方和 SR=0.06547,按式计算可知 F回=10.47＞F0.05(5,5)=5.05。F检验表明,方程的显著水平为 0.05。回归方程的显著性检验见公式(1)。

2.5.5.3 失拟检验 失拟平方和 Slf=0.014,误差平方和 Se=0.051,由式可知 Flf=0.1854。统计量 Flf＜1,则表明已求得方程是不失拟的,即拟合的较好。见公式(2)。

2.5.5.4 回归方程的变换 将各因素的编码公式带入自然空间中得回归方程如下：Y=3.265-0.027Z4。该回归方程在乙醇浓度为 75%～95%范围内指标值显著,由方程可知随着乙醇浓度的减少,β-谷甾醇的含量越大,当乙醇浓度为 75%时,Y=3.244,实验考察其他各因素均为不显著性因素,因此从实验可操作性、经济性、浪费少等角度选择实验条件为温度45℃、时间 80min、液固比为 25∶1,因此经多元线性回归设计优化出热回流乙醇提取β-谷甾醇方法的最优工艺为：提取温度 45℃、时间 80min、液固比 25∶1、乙醇浓度75%。

3 结论

实验对比分析了九台、四平、德惠地区的玉米须营养素成分,通过测定可知,三个地区玉米须脂肪含量具有差异性,这表明玉米须中各营养成分的含量多少与其产地有关。建立了紫外分光光度法测定玉米须β-谷甾醇含量的实验方法,经测定可知,该方法较为准确,且精密度高,重现性良好,稳定性较高,回收率的相对标准偏差符合实验要求。

通过单因素实验,考察了提取温度、时间、液固比及乙醇浓度对玉米须β-谷甾醇含量的影响,并在最优提取参数基础上设计了多元线性回归实验。经回归系数检验、回归方程的显著性检验及失拟性检验后,乙醇浓度和提取温度及时间的交互作用为显著性因素,显著性水平分别为 0.05和 0.25,并且回归方程显著且不失拟。热回流乙醇提取β-谷甾醇方法的最优工艺为,提取温度 45℃、时间 80min、液固比25∶1、乙醇浓度 75%,此时β-谷甾醇含量为 1.52%。

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Extraction ofβ-sitosterol from stigm a m aydis by m ultiple linear regression design

ZHAO W en-zhu,YU Zhi-peng,YU Y i-ding,L IU Jing-bo＊
(Laboratory ofNutrition and Functional Food,College ofQuarter master Technology,JilinUniversity,Changchun 130062,China)

O b jec tive to es tab lish the assay m e thod of s tigm a m ayd isβ-s itos te rol content and m ult ip le linea r reg ress ion m ode l of the hot backs tream ing extrac ting.The re la tionship was s tud ied be tween theβ-s itos te rol contentw ith the fac tors of extrac t temp e ra ture,extrac t t im e,a lcohol concentra tion,the ra tio of dosage liquor.The extrac ting m ode l was des igned by m ult ip le linea r reg ress ion.The results showed tha t the fac tor of the a lcohol concentra tion was s ignificant and the m ode lwas not lack fit.The bes t extrac ting technology was45℃,80m in,75% of the a lcohol concentra tion,the ra tio of solid to liquid was25∶1,and the extrac ting ra tio ofβ-s te rolwas1.52%.

s tigm a m ayd isβ - s itos te rol;UV de tec tion; hotbacks tream ing extrac ting;m ult ip le linea r reg ress ion des ign

TS201.2

A

1002-0306(2010)03-0306-05

甾醇因其呈固态又称为固醇,如胆固醇、谷固醇等,广泛存在于各种谷类、粮食中,并且在糙米中的植物甾醇含量很高[1]。现已鉴别出天然甾醇 160种,据来源不同也可分为植物甾醇、动物甾醇和菌类甾醇三大类。植物甾醇主要有谷甾醇、菜油甾醇和豆甾醇,主要存在于植物的油脂中[2],植物甾醇是一种类似于环状醇结构的物质[3],谷甾醇和豆甾醇的 R基是乙基,而谷甾醇没有侧链上的双键。甾醇主要存在于油类物质的不皂化物中,不同植物油中所含的植物甾醇是不一样的。植物甾醇具有降低胆固醇[4-5]、抑制癌细胞生长[6]、防止前列腺肥大[7]及调节血脂[8]等功效,是当前世界甾体药物迫切需要的重要药源。植物甾醇和植物甾醇衍生物由于其特有的生物学特性和理化特性[9]被广泛地应用于医药、食品、化妆品、饲料[10]等行业。目前,国内外对β-谷甾醇的检测大部分采用样品中加入浓硫酸和醋酸酐显色[11],利用可见分光光度计测定或 HPLC法[12],但由于醋酸酐为毒品不易购买,HPLC测定法操作繁琐,且实验花销较大,因此玉米须β-谷甾醇的测定在前人的基础上,采用不加显色剂,在紫外光下测定甾醇含量[13],并建立可靠的测定方法。本文通过热回流提取工艺,对玉米须中β-谷甾醇进行提取,通过单因素实验筛选最优提取参数,并在此基础上进行多元线性回归设计,得出最佳实验方法,为玉米须营养物质的开发奠定了基础。

2009-10-12 ＊通讯联系人

赵文竹 (1986-),女,硕士研究生,研究方向：营养与功能食品。