纤维素酶提取苹果渣黄酮及抗氧化研究

王岩岩,刘 涛,张崇尧,尹琳琳,吴光旭

(长江大学生命科学院,湖北荆州 434100)

纤维素酶提取苹果渣黄酮及抗氧化研究

王岩岩,刘 涛,张崇尧,尹琳琳,吴光旭＊

(长江大学生命科学院,湖北荆州 434100)

研究了纤维素酶提取苹果渣黄酮的工艺条件及抗氧化活性。结果表明,与传统化学法相比,纤维素酶法提取苹果渣黄酮较好,黄酮提取率从 0.43%提高到 0.56%。对酶法提取工艺进行优化,得到最佳工艺条件为：纤维素酶浓度 0.2%,pH=5.2,酶解温度 60℃,酶解时间 40min。在最佳条件下,纤维素酶法所得黄酮的提取率可达到 1.26%,为化学法黄酮提取率的 2.93倍。并对提取的黄酮进行羟自由基清除实验,发现酶法与化学法提取黄酮的成分清除能力相似,表明两种方法提取黄酮物质结构可能一样。

纤维素酶,黄酮,苹果渣

苹果 荆州市水果市场,榨汁后,60℃通风干燥3d,粉碎过40目筛备用;纤维素酶 酶活性≥10U/mg,上海国药集团化学试剂公司;芦丁标准品 中国药品生物制品检定所,分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 苹果渣黄酮的提取

1.2.1.1 醇提法[3]将烘干过的苹果渣粉碎,过 40目筛,称取 3.00g,加入 90%乙醇水溶液 100mL浸提3h,收集浸提液,滤渣重复浸提一次,合并两次的浸提液,过滤,蒸馏浓缩,用蒸发皿挥干得粗黄酮类物质呈棕红色膏状(W1)。

1.2.1.2 纤维素酶法[4]称取苹果渣粉 3.00g,放入250mL烧杯中,加入0.050g纤维素酶,加入 50mL(pH =4.8)的 HAc-NaAc缓冲液,50℃水浴 1.5h。90℃水浴 30min使酶灭活。加入无水乙醇使其浓度为90%,浸提 3h,回收浸提液,滤渣再加入 90%乙醇溶液 100mL重复浸提一次,合并两次的浸提液,过滤,蒸馏浓缩,用蒸发皿挥干得粗黄酮类物质呈棕红色膏状

1.2.2 黄酮含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制[1]准确称取 0.0250芦丁,用 30%乙醇溶解,完全移入 250mL容量瓶中,定容。取此芦丁标准液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL放入 6支25mL容量瓶中,用 30%乙醇补至 5mL,加入 0.3mL 5%NaNO2溶液摇匀放置 6min;加入 0.3mL 10% Al(NO3)3溶液摇匀,放置 6min;加入 4mL,1mol/L NaOH溶液,摇匀,放置 10min,于波长 510nm处测定吸光度。得回归方程：y=1.0713x+0.0037,R2= 0.9998。其中：x表示芦丁浓度 (10-4g/L),y表示对应吸光值(OD)。

1.2.2.2 提取物中黄酮含量的测定 准确称取适量的苹果渣粗黄酮 (W2),用 30%乙醇溶解,定容至100mL;取 5mL放入 3支 25mL容量瓶中,用 30%乙醇补至10mL,加入0.3mL的5%NaNO2溶液摇匀,放置 5min,加 0.7mL 10%的 Al(NO3)3溶液摇匀,放置6min;再加入 4mL 1mol/L NaOH溶液,摇匀,定容,放置 10min后,在波长 510nm测定,将测定的吸光值A带入芦丁标准曲线中,计算得总黄酮量和黄酮提取率。计算公式如下：

总黄酮量 (g)=W1×(A-0.0037)×0.0001× 100/W2×1.0713

总黄酮提取率(%)=(总黄酮量/W1)×100%

粗黄酮物质提取率(%)=(粗黄酮重量/样品重量)×100%

其中：W1为不同方法提取得到的苹果渣粗黄酮重量(g);W2为称取的适量苹果渣粗黄酮重量 (g); A表示测定的吸光度。

1.2.3 正交设计 根据单因素实验,选取对提取工艺有影响的主要因素：酶浓度 (E)、酶解温度 (T)、pH、酶解时间 (t),按照四因素三水平进行 L9(34)实验,各因素水平见表 1。

表1 实验因素水平表

1.2.4 清除羟基自由基活性[5]取 10mL具塞试管,按顺序加入 5mmol/L邻二氮菲 1.5mL、0.5mol/L磷酸缓冲液 pH7.4 3mL、7.5mmol/L FeSO41mL、粗黄酮样液 3mL、0.1%H2O21mL,用二次蒸馏水稀释到 10mL,然后于 37℃恒温水浴锅保温 60min,测 A510。未损伤管即：不加 H2O2及抗氧化药物,标记为 A510(未损伤)。损伤管即：只加 H2O2不加抗氧化药物,标记为A510(损伤)。按下式计算表观羟自由基清除率 (E)：

E=[A510(加药)-A510(损伤)]/[A510(未损伤)-A510(损伤)]×100%

2 结果与分析

2.1 纤维素酶法提取苹果渣黄酮工艺条件研究

在纤维素酶法提取苹果渣黄酮的过程中,研究了 pH、酶浓度(E)、酶解时间(t)、酶解温度对黄酮提取的影响。

2.1.1 pH的影响 在酶解温度为 50℃,酶解时间为1.5h,酶浓度为 0.1%的条件下,研究了具有不同 pH的 HAc-NaAc缓冲液对提取黄酮的影响。

从表 2中可以看出,随着 pH的升高,提取得到的苹果渣中粗黄酮量先升高,后下降。在 pH为 4.8时,粗黄酮达到最高为 2.13g。提取率也随着 pH的升高而提高,但是在 pH为 5.6时达到最大为 0.81%,故最佳 pH可以选择 5.6。

表2 pH对黄酮提取的影响

2.1.2 酶浓度的影响 在选定酶解温度 50℃,HAc-NaAc缓冲液 pH=5.6,酶解时间为 1.5h的条件下,研究酶浓度对黄酮提取的影响。由表 3可得出,在纤维素酶的用量为 0.2%时,黄酮的提取率最高,为0.81%。因此,提取黄酮的纤维素酶的用量选用0.2%。

表3 酶浓度对黄酮提取的影响

2.1.3 酶解时间的影响 酶解时间对苹果渣黄酮的提取也有一定影响。在 T=50℃、pH=5.6、E=0.2%时,从表 4中可以看出,当酶解 1h,黄酮的提取率最高可达到 1.10%。因此宜选用酶解时间为 1h。

表4 酶解时间对黄酮提取的影响

2.1.4 酶解温度的影响 在 pH=5.6、t=1.0h、E= 0.2%条件下,酶解过程中分别采用不同的温度进行水浴,研究温度对纤维素酶提取苹果渣黄酮的影响。结果如表 5所示,在 40℃粗黄酮提取量最高,为 2.349g;而 50℃下提取的粗黄酮最低,为 2.193g。但是由于 40℃下苹果渣中总黄酮的提取量较少,仅能达到 0.0205g,提取率为 0.87%;而 55℃下黄酮的提取率可达到 1.21%,因此最佳温度选用55℃为宜。

表5 酶解温度对黄酮提取的影响

2.1.5 正交实验 通过单因素实验可以发现,酶用量、酶解时间、酶解 pH及酶解温度对纤维素酶提取苹果渣黄酮得率影响较大。且初步优化工艺条件为：E=0.2%、T=55℃、pH=5.6,t=60m in。在此基础上设计四因素三水平的正交实验,结果如表6。

表 8 化学法和酶法提取黄酮清除羟自由基活性的比较

表6 正交实验结果

分析黄酮提取率正交实验表结果,可以发现 A因素的 K2最大,B因素的 K3最大,C因素的 K3最大,D因素的 K1最大。因此,优化工艺条件为A2B3C3D1,即纤维素酶用量 0.20%,pH=5.2,酶解温度 60℃,酶解时间 80min。而总黄酮得率正交实验表结果表明,A因素的 K2最大,B因素的 K3最大,C因素的 K1最大,D因素的 K1最大。故最佳工艺为A2B3C1D1。由极差分析结果可以看出,影响黄酮提取率的因素主次顺序为A(酶浓度)→D(pH)→B(酶解温度)→C(酶解时间)。而影响总黄酮得率的实验结果的因素主次顺序为 A(酶浓度)→B(酶解温度)→D(pH)→C(酶解时间)。

由于纤维素酶的价格比较昂贵,从工业生产及经济因素考虑,综合上述分析得到优化工艺条件为A2B3C1D1,即纤维素酶用量 0.2%,pH=5.2,酶解温度60℃,酶解时间 40min。

2.2 酶法与化学法提取苹果渣黄酮

2.2.1 不同方法提取总黄酮含量 在酶解工艺优化条件(纤维素酶用量 0.2%、pH=5.2、酶解温度 60℃、酶解时间 40min)下,纤维素酶酶解后提取得到的苹果渣黄酮提取率为 1.26%,与乙醇提取法相比,增加了 2倍左右。提取得到的苹果渣总黄酮量也有明显的提高,由 0.0124g上升到 0.0291g,为乙醇提取得到的总黄酮量的两倍左右,见表 7。

2.2.2 不同方法提取黄酮清除羟自由基活性 从表 8中可以看出,两种方式所提取的黄酮,清除羟自由基活性极为相似,几乎没有差别,初步可以说明采用化学法或酶法所提取的黄酮的结构和成分基本一致。同时从表 8中也可以看出,苹果渣黄酮的清除羟自由基能力随黄酮含量的增加而逐渐增强,在浓度为 1.0mg/mL时,其清除羟自由基活性分别能达到56.20%(化学法)和 56.43%(酶法),说明所提取的苹果渣黄酮有较强的抗氧化能力。

表7 化学法和酶法的比较

3 结论

植物的细胞壁由纤维素组成,而有效成分往往被包裹在细胞壁内。纤维素酶可以破坏细胞壁,从而使有效成分容易溶出[6]。本研究中先通过纤维素酶处理苹果渣,再提取其中的黄酮类有效成分,结果表明,纤维素酶处理后的提取率明显增加。并通过正交实验得到纤维素酶提取的优化工艺条件为：pH =5.2、T=60℃、t=40min、E=0.2%。在优化条件下,酶法提取黄酮的提取率可达到 1.26%,与乙醇提取法相比,黄酮提取率有明显提高。

对提取黄酮进行羟自由基清除实验,发现酶法与化学法提取黄酮成分清除能力相似,表明两种方法提取黄酮物质结构可能一样。说明纤维素酶酶解提取苹果渣黄酮时并不破坏其中的有效成分,纤维素酶可用来提取苹果渣黄酮。

由于中药材存在质地和成分的差异,因此将纤维素酶用于其广泛的提取需要进一步深入研究。

[1]任静,李多伟,王童文 .超声萃取苹果渣中总黄酮工艺的研究[J].中成药,2003,25(9)：761-762.

[2]马田田 .纤维素酶用于中药提取的初步研究 .中草药, 1994,25(3)：123-139.

[3]马桔云,赵晶岩,姜颖,等 .纤维素酶在黄连提取工艺中的应用[J].中草药,2000,31(2)：104.

[4]杨洋 .柚皮黄酮抗氧化机理及其含量的测定[J].广西轻工业,2002(1)：36-38.

[5]张静丽,王宏勋,张雯,等 .灵芝,枸杞多糖复合抗氧化作用[J].食品与机械,2004,20(6)：11-12,46.

[6]冯晓萍,查忠勇,王槐三 .银杏叶黄酮提取工艺研究现状[J].四川化工与腐蚀监控,2002,5(2)：13-17.

Study on extraction of flavanoid from apple pomace by cellulase and its antioxidation activities

WANG Yan-yan,L IU Tao,ZHANG Chong-yao,Y IN L in-lin,W U Guang-xu＊
(Life and Science College of Yangtze University,Jingzhou 434100,China)

In this p ap e r,the extrac tion cond itions of flavanoid from app le p om ace by ce llulose and its antioxida tion ac tivities we re inves tiga ted.The results showed tha t the yie ld of flavanoid from app le p om ace was highe r by us ing enzym e m e thod than by us ing trad itiona l chem ica lm e thod,the ob ta ining ra te of flavanoid inc reased from0.43% to 0.56%.In add ition,the orthogona l exp e r im entwas used to find the m os t suitab le extrac ted cond itions of flavanoid. And the op t im um cond itions we re as follows：ce llulase concentra tion was0.2%,pH was5.2,temp e ra ture and t im e for enzym e hyd rolys is was a t60℃ and40m in,resp ec tive ly.Unde r the op t im um cond itions,the extrac tion ra te of flavanoid from app le p om ace could reach1.26% by ce llulase,which was2.93t im es than tha t by us ing chem ica l m e thod.Add tiona lly,the extrac ted flavanoid us ing enzym a tic and chem ica l m e thods showed s im ila r antioxida tion ac tivity,which ind ica ted tha t ce llulase d id not des troy the comp onents of flavanoid.

ce llulase;flavanoid;app le p om ace

TS255.1

B

1002-0306(2010)02-0252-03

我国苹果资源十分丰富,目前人们主要将其果肉用于饮料和酿造工业,而对其副产品苹果渣很少利用。根据分析苹果渣中含有多种黄酮类化合物,黄酮类物质有显著的生理活性,如降血脂、降低胆固醇作用、清除自由基等,所以不断将其应用于医药及保健食品行业[1]。近年来,纤维素酶逐渐应用于中草药有效成分提取,如马田田等[2]将纤维素酶用于黄柏小檗碱提取的预处理,小檗碱的收率可从 0.87%提高到 1.17%。本实验将纤维素酶用于苹果渣黄酮的提取,以苹果渣中提取的粗黄酮重量、总黄酮重量、提取率为指标,对纤维素酶提取苹果渣黄酮的工艺条件进行了初步优化,为酶法提取中药材提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

2008-11-26 ＊通讯联系人

王岩岩(1980-),女,硕士,讲师,主要从事食品生物技术教学及研究工作。