海藻酸钠、卡拉胶联合固定化木瓜蛋白酶特性研究

唐远谋，焦士蓉，朱清华，唐鹏程，闵 甜

（西华大学生物工程学院，四川成都610039）

海藻酸钠、卡拉胶联合固定化木瓜蛋白酶特性研究

唐远谋，焦士蓉*，朱清华，唐鹏程，闵 甜

（西华大学生物工程学院，四川成都610039）

以海藻酸钠、卡拉胶共混包埋制备固定化木瓜蛋白酶，并对木瓜蛋白酶固定化条件和固定化酶的部分性能进行了探讨。在海藻酸钠浓度1.5%、卡拉胶浓度0.8%、木瓜蛋白酶浓度1.0%、氯化钙浓度4.0%、固定化时间11h、固定化温度为35℃、固定化pH7.5的条件下，可以获得最佳的固定化效果，固定化酶活力回收率为56.27%。与游离酶相比，制备固定化酶的最适酶促反应pH由7.0降至6.5，最适酶促反应温度由40℃升至50℃，其作用温度范围、pH范围均比游离酶范围宽。

木瓜蛋白酶，固定化酶，海藻酸钠，卡拉胶

木瓜蛋白酶 北京奥博星生物技术责任有限公司；海藻酸钠、L－酪氨酸、干酪素 成都科龙化工试剂厂；卡拉胶 天津市博迪化工有限公司；其余试剂均为分析纯。

SHZ－D（Ⅲ）循环水式真空泵，DHG－9070A电热恒温鼓风干燥箱，HH－S4数显恒温水浴锅，电子天平，UV－2600型紫外可见分光光度计，家用冷冻冷藏箱，WTL超微台式离心机，酸度计（PHS－3C）。

1.2 实验方法

1.2.1 固定化木瓜蛋白酶的制备 参照文献［5］的方法固定木瓜蛋白酶。在测定固定化木瓜蛋白酶活力之前将经过一段时间硬化的固定化酶颗粒进行抽滤，并在恒温干燥箱中40℃下干燥1h后取出称其总重m0。

1.2.2 酶活力的测定方法［6］取试管1：加入游离木瓜蛋白酶液1mL，pH7.5的磷酸盐缓冲液3mL，40℃水保温10min，精确加入40℃预热的2%酪蛋白溶液5.0mL，混合均匀，立刻置于40℃水浴中，每隔5min振摇一次，反应45min后，加入5.0mL的10%三氯乙酸，迅速摇匀终止反应。

取试管2：同试管1的做法，改变酪蛋白和三氯乙酸的加入顺序。

将上述试管溶液于3500r/min离心10min，分别取上清液。以试管2离心上清液作为试管1的参比，在波长275nm处测定试管1的吸光度A。

酪氨酸对照液的测定：以0.2mol/L盐酸溶液作参比，在波长275nm处测定酪氨酸对照液的光吸收值As。

酶活力的计算公式如下：

式中：A－试管1测定的光吸收值；As－酪氨酸对照液的光吸收值；C对照－酪氨酸的浓度（!g/mL）；M对照－酪氨酸的分子量（181.19）；V总－反应总体积（mL）；V样品－加入的样液的体积（mL）；m样品－加入的样品的质量（g）；t－反应时间（min）；n－样品的稀释倍数。

酶活力的回收：

1.2.3 单因素实验 选取海藻酸钠浓度、卡拉胶浓度、木瓜蛋白酶浓度、氯化钙浓度、固定化时间、固定化温度、固定化pH进行单因素实验，逐一实验时固定其他6个条件，各选取不同的因子不同水平进行固定化研究。

1.2.4 正交实验 根据单因素实验结果，以海藻酸钠浓度、固定化温度、酶固定化pH、氯化钙浓度，这4个因素设计正交实验。

1.2.5 木瓜蛋白酶游离酶和固定化酶的特性（最适酶促反应pH和温度）研究 在pH7.0的缓冲液中配制酶溶液，酶浓度为1.0%，所取反应液为1.0mL，固定其他条件，在pH6.0～8.0、温度20～60℃之间的磷酸缓冲液中分别测定固定化酶和游离酶的相对活性。

2 结果与分析

2.1 木瓜蛋白酶最适固定化条件的单因素实验

2.1.1 海藻酸钠浓度的确定 海藻酸钠浓度不仅影响酶的固定率，还影响到胶珠的成型和反应性能。浓度太低不能成珠；浓度过高挤珠困难，还会使得壁材过厚，降低灵敏度［7］。由表1可知，当海藻酸钠浓度为1.5%时，酶活力回收率最大。

表1 海藻酸钠浓度对酶固定化的影响

2.1.2 卡拉胶浓度的确定 当卡拉胶浓度较低时，固定化颗粒较小，较软，当增大到一定浓度时，固定化酶活力变化不大。由表2确定卡拉胶最适浓度为0.8%。

表2 卡拉胶浓度对酶固定化的影响

2.1.3 木瓜蛋白酶浓度的确定 从表3看出，当酶浓度为1.0%时，制备的固定化酶活力达到最大值。

表3 木瓜蛋白酶浓度对酶固定化影响

2.1.4 氯化钙浓度的确定 氯化钙与海藻酸钠反应形成海藻酸钙凝胶是包埋法固定化酶的一个重要过程，同时氯化钙对形成凝胶的机械强度也有重要影响。由表4可知，最适氯化钙浓度为4.0%。

表4 氯化钙浓度对酶固定化的影响

2.1.5 固定化时间的确定 随着固定化时间的增加，固定化酶相对活力呈上升趋势，当上升到一定程度便趋于稳定。由表5可知，固定化时间为11h。

表5 固定化时间对酶固定化的影响

2.1.6 固定化温度的确定 温度增加时，酶在固定化过程中活力损失增加，由表6可知，最适固定化温度为45℃。

表6 固定化温度对酶固定化的影响

2.1.7 固定化pH的确定 实验结果见表7，得到最适固定化pH为7.0。

表7 固定化pH对酶固定化的影响

2.2 木瓜蛋白酶固定化的正交实验

正交实验结果见表8。

表8 L9（34）正交实验结果表

由极差R可知，各因素对固定化酶活力回收率次序为：D＞C＞B＞A，温度为主要因素，固定化最佳方案是A2B2C3D1，即海藻酸钠浓度为1.5%，固定化温度为35℃，固定化pH为7.5，氯化钙溶液浓度为4.0%。以此条件进行实验，固定化酶活力回收率为56.27%。

2.3 木瓜蛋白酶游离酶和固定化酶的特性

2.3.1 最适酶促反应pH 结果见图1。由图1可得，固定化酶最适pH为6.5，游离酶的最适pH7.0，固定化酶比游离酶较耐酸，显示出比游离酶更宽泛的pH适应性，其原因可能是固定化载体维持了酶空间结构的稳定性。

图1 最适酶促反应pH

2.3.2 最适酶促反应温度 结果见图2。由图2可以看出，固定化酶的最适温度为50℃，比游离酶的最适温度40℃高出10℃，且对于高温有更好的稳定性。这表明固定化提高了木瓜蛋白酶的热稳定性，分析原因可能是固定化载体提高了酶的空间结构对热的稳定性。

图2 最适酶促反应温度

3 结论

3.1 由单因素实验及正交实验，得到最优水平组合，即海藻酸钠浓度1.5%、卡拉胶浓度0.8%、木瓜蛋白酶浓度1.0%、氯化钙浓度4.0%、固定化时间为11h、固定化温度为35℃、固定化pH为7.5，以此条件固定化木瓜蛋白酶，其酶活力回收率达56.27%。

3.2 探究固定化酶的特性与游离酶相比，得知固定化酶比游离酶较耐酸，显示出比游离酶更宽泛的pH适应性，且对于高温有更好的稳定性。

［1］乙引，张显强，唐金刚，等.木瓜蛋白酶的纯化和性质［J］.贵州师范大学学报，2002，20（1）：11－14.

［2］Nitsawang S，Raini H K，Kanasawud P.Purification of pa－pare from carlca papaya latex：Aqueous two－phase extraction versus two－step salt precipitation［J］.Enzyme Microb Techn，2006，39（5）：1103－1106.

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Study on immobilized papain property with alginate and gum kala mixture

TANG Yuan－mou，JIAO Shi－rong*，ZHU Qing－hua，TANG Peng－cheng，MIN Tian
（School of Bioengineering of Xihua University，Chengdu 610039，China）

Papain was immobilized by encapsulated in hydrogel beads prepared with alginate and gum kala，the immobilization conditions and partial properties of immobilized enzyme were investigated.The recovery of immobilized enzyme activity after 11h of immobilization at 35℃ and pH 7.5 was 56.27%，under the optimum operation conditions that the concentration of sodium alginate，gum kala，papain and CaCl2solution were 1.5%，0.8%，1.0%and 4.0%respectively.Compared with the free enzyme，the optimum pH value of immobilized papain decreased form 7.0 to 6.5，while the temperature increased from 40℃ to 50℃，which showed a wider range of reaction pH value and temperature than the free enzyme.The thermostability of immobilized papain was better than the free enzymes.

papain；immobilized enzyme；alginate；gum kala

TS201.2+5

A

1002－0306（2010）12－0209－03

木瓜蛋白酶（Papain，EC3.4.22.2）是从番木瓜中提取出的一种蛋白水解酶，具有强的蛋白水解活力，又含凝乳和溶菌活力，还具有脂解及蛋白合成功能，在轻纺、食品、医药等工业领域中广泛应用［1－2］。游离的木瓜蛋白酶稳定性较差，并且使用后分离纯化较困难，大大降低了其使用效率。固定化酶具有很好的稳定性且易与底物、产物分离，从而提高了使用效率，正逐步受到人们的重视。海藻酸钠、卡拉胶作为天然高分子材料因其安全、环保以及优良的工艺性能，是食品酶工程中常用的包埋材料［3－4］。本文采用海藻酸钠、卡拉胶联合固定化木瓜蛋白酶，得到了最佳的固定条件并对固定化酶特性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

2010－01－04 *通讯联系人

唐远谋（1986－），男，硕士研究生，研究方向：食品营养与安全。