微波处理对枯草杆菌芽孢致死效果研究

黄 明，黄 峰，周兴虎，邢 悦，周光宏

(南京农业大学 国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095)

微波处理对枯草杆菌芽孢致死效果研究

黄 明，黄 峰，周兴虎，邢 悦，周光宏

(南京农业大学 国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，江苏 南京 210095)

通过比较不同温度和时间下微波和水浴对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死效果，以探讨微波杀菌的热效应与非热效应。枯草杆菌黑色变种芽孢活化后，制成104CFU/mL的孢子悬浮液，然后分别用微波和水浴加热对芽孢进行灭菌，最后测定灭菌后的单位体积菌落总数，计算致死率。结果表明，微波和水浴加热在92℃时的致死率都高于85℃时的致死率。在相同的温度和时间下，微波的杀菌效果好于水浴加热，存在非热效应。只有在92℃，20min时，微波和水浴加热对芽孢的致死率差异不显著，非热效应不明显。

微波；杀菌；热效应；非热效应；枯草杆菌黑色变种芽孢

微波是频率在300MHZ～300GMZ的非电离辐射电磁波，具有穿透力强、能耗少、效率高、处理后无污染等优点[1]，因此在果蔬、肉制品、乳制品等食品加工领域已得到广泛应用[2-4]。由于微波与生物体的相互作用是一个极其复杂的过程[5]，因此人们对微波的杀菌机理还不是很明确。早期的学者认为微波的杀菌作用主要来自于其热效应[6-7]，其依据是微波杀菌在高温时可致死大量微生物，而在低温时灭菌效果明显变差[8]。热效应解释微波杀菌机理虽广为接受，但其并不能解释所有微波杀菌现象，如与水浴加热等传统杀菌方法相比，在致死一定量的微生物前提下，微波杀菌所需时间较短，温度较低[9]。因此，有学者提出微波杀菌除热效应外，还存在非热效应，是两者综合作用的结果[10-11]。

目前，多数微波杀菌实验是以营养体作为研究对象，而对于耐热性较强的芽孢的研究相对还较少。汪保国等[12]采用微波对枯草杆菌黑色变种芽孢进行处理，发现不同时间处理，微波对芽孢的致死率要高于水浴，并认为微波杀菌存在着非热效应。但文中只描述了微波杀菌的时间，没有考虑到温度变化，而实际上温度是对芽孢致死的一个重要因素，因此研究不同温度和时间条件下微波对枯草杆菌芽孢(枯草杆菌芽孢是所有芽孢的典型代表)的致死作用对于阐述微波的非热效应具有重要的理论意义。本实验通过比较水浴和微波照射对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死效果，以探讨微波杀菌的热效应和非热效应。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草杆菌黑色变种芽孢ATCC9372中国科学院微生物所微生物菌种保藏中心；PCA平板计数琼脂 路桥公司。

1.2 仪器与设备

Avanti J-E离心机 贝克曼库尔特公司；YQZG-03型微波杀菌机 南京永青食品保鲜科技发展有限公司；HH-42快速恒温数显水浴锅 常州国华电器公司。

1.3 方法

1.3.1 芽孢制备

从营养琼脂斜面挑取枯草芽孢杆菌黑色变种并接种到营养琼脂平板上，在37℃培养24h，将接种好的平板进行轮换培养(冰箱4℃，恒温培养箱37℃，轮换周期为2d)1个月，然后观察芽孢的数量变化，直到芽孢数量达到90%，方可制备芽孢悬液。

1.3.2 孢子悬浮液制备

用生理盐水对芽孢平板进行洗脱，将洗脱液装入试管，然后在3500r/min的条件下离心10min，再进行煮沸去除杂菌，从而得到孢子浓缩液。芽孢数量测定参考曾庆孝等[13]方法，并稍作修改。吸取10μL制得的浓缩液加入到9.99mL生理盐水中，10倍递减稀释，在37℃条件下培养24h，进行平板计数。然后用生理盐水稀释成104CFU/mL的孢子悬液。向每个培养皿中加入30mL，加盖薄膜备用。

1.3.3 微波杀菌实验

在微波杀菌机的托盘两侧放入加有适量水的烧杯作为负载，然后把装有孢子悬液的培养皿放入托盘中心，孢子悬液的温度可由微波设备顶部的红外探头准确测定。微波所采用的频率为915MHz，杀菌温度分别为85、92℃，杀菌时间分别为5、10、20min，实验中每个处理做4个重复。

1.3.4 水浴杀菌实验

使用恒温水浴锅进行杀菌实验，杀菌温度分别为85、92℃，杀菌时间分别为5、10、20min，实验中每个处理做4个重复。

1.3.5 致死效果检验

吸取微波和水浴杀菌后的孢子悬液各1mL分别放入营养琼脂平板中，在37℃的条件下培养24h，然后对平板进行拍照，计数，并计算不同处理条件下的致死率。

1.3.6 数据统计分析采用SPSS16.0软件对不同处理条件下的致死率进行分析，多重比较采用邓肯氏新复极差法。

2 结果与分析

2.1 不同温度和时间下微波对枯草杆菌芽孢致死效果

图1 不同温度和时间条件下微波对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死效果Fig.1 Lethal effect of microwave treatment on Bacillus subtilis var. niger at various heating temperatures and time

从图1可以看出，和对照组相比，经过微波照射的枯草杆菌黑色变种芽孢的菌落总数明显减少，致死率差异极显著(P＜0.01)。随着杀菌时间的延长，85℃和92℃条件下的微波对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死率都逐步增大。在杀菌时间为5min和10min时，92℃时微波对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死率要明显大于85℃的致死率(P＜0.05)。但当杀菌时间到20min时，两温度下的芽孢致死率差异不明显(P＞0.05)。两温度条件下的致死率差值从5min时的7.7%到20min时的不足1%。2.2 不同温度和时间下水浴对枯草杆菌芽孢致死效果

图2 不同温度和时间条件下水浴对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死效果Fig.2 Lethal effect of water-bath heating treatment on Bacillus subtilis var. niger at various heating temperatures and time

由图2可知，和对照组相比，水浴处理后枯草杆菌黑色变种芽孢的菌落总数明显降低，致死率差异显著(P＜0.01)。随着水浴时间的延长，85℃和92℃条件下的水浴对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死率都逐渐增大。在20min的水浴时间内，92℃条件下水浴对枯草杆菌黑色变种芽孢致死率都大于85℃的条件下的致死率(P＜0.05)，但随着水浴时间的延长，两温度条件下的致死率逐渐接近，致死率差值从5min时的6.5%到20min时的2.6%。2.3 微波照射与水浴加热对枯草杆菌芽孢致死效果的对比分析

图3 不同温度和时间下微波照射和水浴加热对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死率对比分析Fig.3 Lethal rates of microwave and water-bath heating treatments on Bacillus subtilis var. niger at various heating temperatures and time

由图3可以看出，在相同的加热温度和时间下，微波对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死率要高于水浴对芽孢的致死率。85℃条件下，在整个加热过程中，微波对芽孢的致死率始终高于水浴对芽孢的致死率(P＜0.05)。在92℃条件下，在加热时间为5min和10min时，微波对芽孢的致死率始终高于水浴对芽孢的致死率(P＜0.05)，但当加热时间到20min时，两者之间的差异不显著(P＞0.05)，都接近于100%。

3 讨 论

微波杀菌的生物效应主要包括热效应和非热效应。热效应是指在微波电磁场中，物体极性分子因发生定向排列而相互摩擦升温，从而致死微生物；非热效应则是微生物组成蛋白质和生理活性物质发生变异从而丧失活力或死亡[14-15]。热效应解释微波杀菌机理已被普遍接受，而至于是否存在非热效应目前还没有定论。一般认为水浴加热只产生热效应，因此可以通过比较微波和水浴的杀菌效果来探讨微波杀菌的非热效应。

目前常用的微波频率主要有2450MHz和915MHz，前者穿透力强，主要用于干燥、解冻等，后者加热能力强，常用于杀菌[16]。传统的微波设备一般只有升温过程，难于准确测定杀菌温度和时间，本实验所用微波杀菌设备具有红外测温系统，可以保证杀菌温度和时间的准确性。从实验结果看，微波杀菌温度越高，微波对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死效果也越明显，这种现象表明微波杀菌热效应的存在。而在相同温度与时间下，微波对枯草杆菌黑色变种芽孢的致死率要高于水浴，这说明微波对芽孢的致死作用除了热效应外，还存在非热效应，是两者综合作用的结果。

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Lethal Effect of Microwave Treatment on Bacillus subtilis var. niger Spores

HUANG Ming，HUANG Feng，ZHOU Xing-hu，XING Yue，ZHOU Guang-hong
(National Center of Meat Quality and Safety Control, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to explore the thermal effect of microwave sterilization, lethal effects of microwave and water-bath heating treatments on Bacillus subtilis var. niger spores were compared at various heating temperatures and time. After the activation of Bacillus subtilis var. niger spores, the spore suspension at the concentration of 104CFU/mL was prepared. Microwave and waterbath heating treatments were used for the sterilization of spores to evaluate the lethal rate. Results indicated that the lethal rate at 92 ℃ was higher than that at 85 ℃ for both microwave and water-bath heating treatments. At the identical condition of heating temperature (85 ℃) and time, the lethal effect of microwave treatment was much better than that of water-bath heating treatment,which was due to an obvious non-thermal effect. However, no obvious difference in lethal rates of microwave and water-bath heating treatments at 92 ℃ for 20 min was exhibited.

microwave；sterilization；thermal effect；non-thermal effect；Bacillus subtilis var. niger spore

Q93.334

A

1002-6630(2010)09-0027-03

2009-09-14

国家“863”计划项目(2008AA100804-5)；江苏省青蓝工程项目(苏教师2008-30)；江苏省科技支撑计划项目(SBC200960038)

黄明(1970—)，男，副教授，博士，主要从事肉品质量与安全控制研究。E-mail：mhuang@njau.edu.cn