Graves病中甲状腺自身抗体的动态变化及相关性分析

章清华，方佩华，张艳丽，李 宁，冯 凭，张宝泉，王英姿

（天津医科大学总医院1.核医学科；2.代谢病科，天津 300052）

Graves病（GD）是一种自身免疫异常，以血清中存在促甲状腺素受体抗体 (thyrotropin receptor antibody，TRAb)为特征的疾病。TRAb与促甲状腺素受体（thyrotropin receptor,TSHR）结合导致受体活化，继而产生一序列GD的临床表现。GD患者血清中还存在针对其他甲状腺抗原的自身抗体，如针对甲状腺过氧化物酶的甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody，TPOAb)。这些抗体在GD中的病理生理作用和它们的变化尚不明确。本次前瞻性研究主要对GD患者中TRAb和TPOAb的演变进行评价，并对它们之间及它们与甲状腺功能之间的相关性进行研究。

1 资料和方法

1.1 临床资料 232例初发的GD患者被纳入本次研究，其中男 67 例，女 165 例，年龄 20～79（30.5±14.6）岁。纳入研究的患者都给予正式的知情同意书。GD的诊断根据临床症状如高代谢症状，弥漫性甲状腺肿大，部分患者具有眼症等；实验室检测有高游离甲状腺素（free thyroxin，FT4），高游离三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）， 低 促 甲 状 腺 素（thyrotropin，TSH），甲状腺高99mTc摄取。所有GD患者都是初次诊断，然后给予抗甲状腺药物（anti-thyroid drug，ATD）治疗（每天甲巯咪唑 15～40mg），同时配用25～75μg左旋甲状腺素（L-T4）以维持正常的甲功状态和临床状态。所有病例分别在诊断时，治疗3、6、12、18和24月时收集血清以备检测。初始诊断时共获取了所有232例GD患者的血清标本，在治疗3、6、12、18 和 24 月时分别获得了 127、117、135、102 和58例标本。血样收集在非抗凝管中，4℃下3500 r/min，离心5min。血清分装后保存在-80℃待检测。

1.2 血清检测

1.2.1 甲状腺功能检测 血清TSH（参考范围0.3～5.0 μIU/ml），FT4(参考范围 11.5～23.5 pmol/L)和 FT3(参考范围3.5～6.5 pmol/L)采用化学发光法检测(ADVIACentaur,Germany)。

1.2.2 TRAb检测 TRAb用ELISA检测[1]。纯化的重组TSHR氨基端蛋白（thyrotropin receptor N terminal，TSHR-N）用0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH 9.6）稀释后，包被酶标板(1 μg/ml,100 μl/孔)，在4℃过夜；洗板并用含0.1%Tween和3%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭1 h；将10μl患者血清用磷酸盐缓冲液进行1:100稀释后，加入酶标板孔内（100μl/孔），放置于 37℃，1 h；洗板后，加入碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体（100μl/孔），放置于37℃，1 h；洗板后，加入底物磷酸对硝基苯酯（p-nitrophenyl phosphate，PNPP，1 mg/ml，pH 9.8，100 μl/孔）放置于37℃，1 h后在酶标仪上405 nm处检测光密度值（OD405），以OD405大于正常人群组P95为阳性（P95时 OD405=0.68，参考范围 0.15～0.68）。

1.2.3 TPOAb检测 TPOAb检测采用ELISA法[2]。采用重组的甲状腺过氧化物酶（TPO）作为抗原进行包被，其他过程同TRAb检测。以OD405大于正常人群组P95为阳性（P95时 OD405=0.74,参考范围 0.13～0.74）。

1.3 统计分析 计量资料用非参数检验进行分析；治疗不同时间时各变量用Kruskal-Wallis test进行检验；计数资料采用χ2检验，采用Pearson检验进行相关性分析。以上统计由SPSS 15.0完成。

2 结果

2.1 TRAb和TPOAb阳性率 TRAb和TPOAb在治疗过程中的变化不尽相同，见表1。

2.2 TRAb和TPOAb水平 详见表2。

表1 TRAb和TPOAb阳性率

表2 TRAb和TPOAb水平

2.3 患者甲状腺功能 治疗3个月时所有患者FT3，FT4都恢复正常，治疗12个月时TSH才完全恢复正常，见表3。

2.4 TRAb和TPOAb相关性分析 进行相关性分析发现，TRAb与TPOAb之间，TRAb与甲状腺功能之间，TPOAb与甲状腺功能之间均无相关性。

表 3 FT3、FT4和 TSH 水平

3 讨论

本研究是为了阐明在GD初发时及抗甲状腺治疗过程中TRAb和TPOAb的变化过程。结果显示TRAb水平和阳性率在ATD治疗过程中都稳步下降，这与之前的研究相一致[3]。实验前，我们认为TPOAb水平及阳性率变化应该与TRAb变化一致。然而事实并非如此，研究发现TPOAb水平在ATD治疗的初期出现了逐步上升，这与TRAb水平从一开始就逐渐下降的趋势相反。进行相关性分析时发现，TRAb和TPOAb的阳性率也是相互独立，无相关性。

之前研究显示，在怀孕过程中，ATD的免疫抑制作用对不同的甲状腺抗体具有选择性[4]，此结果和我们的研究数据表明以往报道的ATD的免疫抑制作用[5]可能对TRAb更明显，对TPOAb相对少一点。在ATD治疗GD过程中，TRAb的亲和力和活性可能会发生变化，已有研究表明，在GD治疗过程中，近半数患者的TRAb表型发生改变[6]，这些变化导致了TRAb刺激活性的下降。近年来制备成功的TSHR单克隆抗体[7]有助于阐明TSHR和其自身抗体之间相互作用的复杂分子机制。

TRAb导致了GD甲亢产生[8]已经为大家所知，然而在GD发生、发展过程中，TPOAb所起的病理作用还不清楚。在GD治疗过程中，TRAb和TPOAb之间并无相关性，这也许能说明它们是针对不同抗原的独立免疫过程。因此，TSHR介导的免疫损害并不能影响到TPO介导的免疫损害，反之亦然。

TPOAb在GD过程中可能提示着二次免疫异常，而不是作为初始的直接抗TPO作用导致的免疫损害，它可能在部分GD转化为慢性淋巴细胞甲状腺炎过程中起作用。当然，之前也有研究表明在部分桥本甲状腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT）患者中也出现了针对TSHR的免疫损伤[9]。也就是说，在这些患者中，并没有显示出清晰的是GD还是HT的免疫异常。在组织病理上表现为具有明显单核细胞浸润的Graves甲状腺毒症。

与TRAb不同，TPOAb不是GD中的主要抗体，它在治疗过程中的变化不同于TRAb。在本次研究中，初发GD患者的TPOAb阳性率（28.9%）比文献报道的要低得多[10]。至少可以从两方面来解释：首先TPOAb不是GD中的主要抗体，只在HT中具有高的阳性率；其次，本次研究中采用重组的TPO作为抗原进行TPOAb检测，由于抗原纯，无其他甲状腺抗原污染，所以检测结果更具特异性，具有更少的假阳性。

总之，在ATD治疗GD早期过程中TPO水平的上升，TRAb和TPOAb之间，甲状腺自身抗体与甲状腺功能之间无相关性，这些结果表明TRAb和TPOAb在GD发生、发展过程中是针对不同抗原的具有独立的免疫异常过程，这种免疫异常与甲状腺功能状态无直接相关。

[1]李宁，方佩华，张艳丽，等.重组人TSHR片段蛋白建立人TRAb ELISA 及应用[J].中华核医学杂志，2009，29（5）：348

[2]张艳丽,方佩华,何红鹏,等.一个新型检测人甲状腺过氧化物酶抗体 ELISA 技术的临床应用[J].天津医药，2008，36（5）：337

[3]Capelli C，Gandossi E,Castellano M,etal.Prognostic value of thyrotropin receptor antibodyies(TRAb)in Graves’Disease:A 120 monthsprospective study[J].Endocr J，2007，54(5)：713

[4]Tamaki H,Amino N,Iwatani Y,et al.Discortant changes in serum anti-TSH receptor antibody and antithyroid microsomal antibody duringpregnancy in autoimmune thyroid disease[J].Thyroidology，1989，1（2）：73

[5]Mcgegor AM,Petersen MM,Mclach lan SM,etal.Cabimazole and autoimmune response in Graves’disease[J].N Engl JMed,1980,303（6）：302

[6]Kim WB,Chung HK,Lee HK,etal.Changes in epitopes for thyroid stimulatingantibodiesin Graves’diseaseseraduring treatmentofhyperthyroidism:therapeutic implication[J].JClin EndocrinolMetab,1997,82（6）：1953

[7]Costagliola S,BonomoM,Morgenthaler NG,etal.Delineation of the discontinuous conformationalepitope of amonoclonal antibody displaying full in vitro and in vivo thyrotropin activity[J].Mol Endocrinol，2004，18(12)：3020

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[10]OkosiemeOE,Taylor RC,Ohwovoriole AE,etal.Lazarusprevalence ofthyroidantibodiesinNigerianpatients[J].QJM,2007,100（2）：107