匙吻鲟软骨蛋白酶解工艺优化

吴 越，沈 硕，熊善柏，赵思明，黄琪琳,*

(1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心，湖北 武汉430070；3.湖北省水产品加工工程技术研究中心，湖北 武汉 430070)

匙吻鲟软骨蛋白酶解工艺优化

吴 越1,2,3，沈 硕1,3，熊善柏1,2,3，赵思明1,2,3，黄琪琳1,2,3,*

(1.华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070；2.国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心，湖北 武汉430070；3.湖北省水产品加工工程技术研究中心，湖北 武汉 430070)

为提高匙吻鲟软骨蛋白的利用价值和生物活性，以匙吻鲟软骨为原料，经微波-碱法提取软骨蛋白，通过单因素试验确定碱性蛋白酶酶解软骨蛋白的关键因素为酶解温度、底物质量分数、pH值和酶的用量。经正交试验优化，确定了酶解的最佳工艺条件。结果表明：最佳酶解工艺条件为酶解温度50℃、软骨蛋白质量分数1%、pH7.5、酶用量9000U、酶解时间5h，在此条件下氨基酸态氮生成率最高，达到21.89%。

匙吻鲟；软骨蛋白；酶解

Abstract：In order to improve the utilization value and biological activity of cartilage protein,Polyodon spathulacartilage was used as the material to extract cartilage protein by microwave-alkali extraction method. The optimal enzymatic hydrolysis conditions of cartilage protein were explored by single factor and orthogonal experiments to be enzymatic hydrolysis temperature of 50 ℃, cartilage protein concentration of 1%, hydrolysis pH of 7.5, alkaline protease amount of 9000 U, and hydrolysis time of 5 h. The yield of amino nitrogen was 21.89% under the optimal conditions.

Key words：Polyodon spathula；cartilage protein；enzymatic hydrolysis

匙吻鲟是地球上最古老和最原始的软骨鱼种之一[1]，属于鲟形目(Acipenserifomes)匙鲟科(Polyodon)。匙吻鲟通体为软骨，素来有“鲨鱼翅、鲟鱼骨，食之明目壮阳，延年益寿”之说[2]。我国匙吻鲟大量养殖，产量增加，软骨也随之增多[3]。从鲨鱼软骨中提取得到对肿瘤和胚胎的新生血管生长具有抑制作用的活性因子，并证实它是一种蛋白质[4-7]。据文献报道[8-10]，匙吻鲟软骨中含有抗癌、降血脂、降胆固醇、增加人体免疫力以及美容保健等功效成分。其中主要的功效成分为蛋白和多糖，而软骨蛋白具有较大的分子质量，利用生物方法或碱对蛋白进行处理，可以降低其分子质量，从而提高软骨蛋白的利用价值和生物活性[11]。因此本研究采用微波-碱法提取软骨蛋白，以碱性蛋白酶酶解软骨蛋白，并通过单因素和正交试验确定酶解的最佳工艺，为今后匙吻鲟功效成分的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

匙吻鲟软骨：由仙桃水产品推广中心提供活鱼，本实验室制备，并粉碎至1～2mm备用；碱性蛋白酶(酶活12000U/g) 广西庞博生物工程有限公司。

AC2IOS型电子分析天平 德国Sartorius公司；HH-6型电子恒温水浴锅 江苏省常州市国华电器有限公司；818型pH计 美国奥立龙公司；TDL-5-A型离心机 上海安亭科学仪器；UV265FW型紫外-可见分光光度计日本Shimadzu公司。

1.2 方法

1.2.1 软骨蛋白的制备

称取一定量的软骨加入质量分数为0.9%的稀碱溶液[液料比为15:1(mL/g)]，置于小烧杯中，用玻璃盖好，在360W条件下，采用间歇式微波加热，然后取出冷却，用盐酸调节pH值至中性，离心(3000r/min，10min)取上清液，加入等体积的95%乙醇，4℃放置过夜，离心后取沉淀，用少量蒸馏水溶解，冷冻干燥，得软骨蛋白。

1.2.2 测定方法

蛋白酶活力测定用Folin-酚法[12]；氨基酸态氮含量测定用茚三酮法[13]；总氮含量测定用微量凯氏定氮法(GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白质的测定》)。氨基酸态氮生成率的计算：DH=AN/TN×100(式中：DH为氨基酸态氮生成率/%；AN为氨基酸态氮含量/%；TN为总氮含量/%)。

1.3 酶解软骨蛋白的单因素试验

1.3.1 温度对氨基酸态氮生成率的影响

配制一系列质量分数为1%的软骨蛋白溶液，在pH8.0的条件下，加入碱性蛋白酶9000U，分别在30、35、40、45、50、55、60、65℃条件下保温5h后，100℃水浴灭酶5min，取酶解液测氨基酸态氮生成率。

1.3.2 酶用量对氨基酸态氮生成率的影响

配制一系列质量分数为1%的软骨蛋白溶液，在pH8.0的条件下，分别加入250、750、1000、2000、3000、6000、9000、12000U的碱性蛋白酶，于50℃保温5h后，100℃水浴灭酶5min，取酶解液测氨基酸态氮生成率。

1.3.3 底物质量分数对氨基酸态氮生成率的影响

分别配制质量分数为0.5%、l%、2%、3%、4%、5%的软骨蛋白溶液，在pH8.0的条件下，加入碱性蛋白酶9000U，50℃保温5h后，100℃水浴灭酶5min，取酶解液测氨基酸态氮生成率。

1.3.4 pH值对氨基酸态氮生成率的影响

分别选择体系pH6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，底物质量分数为1%，加入碱性蛋白酶9000U，50℃保温5h后，100℃水浴灭酶5min，取酶解液测氨基酸态氮生成率。

1.3.5 酶解时间对氨基酸态氮生成率的影响

配制一系列质量分数为1%的软骨蛋白溶液，在pH8.0的条件下，加入碱性蛋白酶9000U，于50℃分别保温1、2、3、4、5、6、7 h后，100℃水浴灭酶5min，取酶解液测氨基酸态氮生成率。

1.4 正交试验

根据单因素试验结果，对酶解pH值、温度、底物质量分数及酶用量进行四因素三水平正交试验，因素水平设计如表1所示，以氨基酸态氮生成率为指标确定酶解最佳工艺条件。

表1 正交试验的因素水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.5 试验数据处理

采用SAS 8.1和Origin 8.0软件进行数据处理[14]。

2 结果与分析

2.1 温度对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响

图1 温度对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由图1可知，随温度的升高，氨基酸态氮生成率增加，当温度达到50℃时，氨基酸态氮生成率最高，当温度高于50℃时，氨基酸态氮生成率反而下降；其原因是酶有其最适的反应温度，在一定温度范围内，温度升高酶促反应的速度会增加，但温度过高时，会引起酶变性而丧失其催化活性，当酶达到最适的反应温度时，酶的活力最大，水解蛋白质的量越多[15-16]。

2.2 酶用量对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响

图2 酶用量对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响Fig.2 Effect of enzyme amount on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由图2可知，随酶用量的增加，氨基酸态氮生成率逐渐提高，在250～6000U范围内，氨基酸态氮生成率增加较快，在达到9000U时，继续增加酶的用量，氨基酸态氮生成率的变化不大。根据酶的酶解特性，酶的用量过多会造成浪费，过少会使水解不彻底[17]，故综合分析后选择酶的用量为9000U。

2.3 底物质量分数对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响

图3 底物质量分数对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由图3可知，在底物质量分数较低的情况下，氨基酸态氮生成率随底物质量分数的增加而增加，当底物添加量为1.0%时，氨基酸态氮生成率最高，而底物质量分数过高，黏度太大，阻碍了酶和底物充分接触，不利于酶解的进行，氨基酸态氮生成率反而降低，这和李秀霞等[18]在研究鸡骨蛋白酶解工艺中的结果一致。

2.4 pH值对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响

图4 pH值对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响Fig.4 Effect of pH on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由图4可知，开始时，随着pH值的升高，氨基酸态氮生成率逐渐增大，当pH值达到8.0时，氨基酸态氮生成率达到最大值，当pH＞8.0时氨基酸态氮生成率开始下降，因此酶解的最适pH值为8.0。酶活力对其环境pH值十分敏感，因为环境的pH值直接影响着酶及蛋白质分子某些解离基团的解离状态，只有在特定的pH值条件下，解离基团处于特定的解离状态时，酶分子与底物蛋白分子才会结合得更快更好，酶解速度也就更快[19]，即单位时间内的生成率就高。

2.5 酶解时间对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响

图5 酶解时间对软骨蛋白氨基酸态氮生成率的影响Fig.5 Effect of hydrolysis time on the yield of amino nitrogen from cartilage protein

由图5可知，随着酶解时间的延长，软骨蛋白氨基酸态氮生成率逐渐增加，在1～5h时，氨基酸态氮生成率增加较快，但反应时间达到5h后增加的速度较慢，因此，选择酶解时间为5h。

2.6 正交试验

通过单因素试验，确立了各个单因素酶解的最佳水平值。在此基础上，进一步优化考察范围，以便确立最佳的工艺水平条件。正交试验结果如表2所示。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Design and results of orthogonal experiments

极值R越大，说明该因素的影响效应越大，从表2中可以看出，影响匙吻鲟鱼酶解的因素依次为温度＞底物质量分数＞pH值＞酶用量，即温度的影响最大，其他因素较小。从试验结果得出，最佳酶解工艺条件为A1B2C2D2，即酶解温度50℃、底物质量分数1%、pH7.5、酶用量9000U，此时氨基酸态氮生成率为21.89%。

3 结 论

通过单因素试验，对影响碱性蛋白酶酶解匙吻鲟软骨蛋白的几个关键因素进行考察，在此基础上通过正交试验对其进行优化，得到最佳酶解工艺条件为酶解温度50℃、底物质量分数1%、pH7.5、酶用量9000U。在此条件下酶解5h，氨基酸态氮生成率最高，达到21.89%。

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Optimal Enzymatic Degradation of Cartilage Protein fromPolyodon spathula

WU Yue1,2,3，SHEN Shuo1,3，XIONG Shan-bai1,2,3，ZHAO Si-ming1,2,3，HUANG Qi-lin1,2,3,*
(1. College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. National R & D Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing, Wuhan 430070, China；3. Aquatic Product Engineering and Technology Research Center of Hubei Province, Wuhan 430070, China)

TS254.4

A

1002-6630(2010)22-0160-04

2010-06-30

“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD30B01)

吴越(1987—)，男，硕士研究生，研究方向为农产品加工及贮藏工程。E-mail：warden1987210@yahoo.com.cn

*通信作者：黄琪琳(1974—)，女，副教授，博士，研究方向为食品大分子结构及功能特性。E-mail：hql@mail.hzau.edu.cn