响应面法优化匀浆提取刺五加主要酚苷及苷元的工艺

刘 洋，杨 磊，郝婧玮，祖元刚

（东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

研究开发

响应面法优化匀浆提取刺五加主要酚苷及苷元的工艺

刘 洋，杨 磊，郝婧玮，祖元刚

（东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150040）

采用响应面法对匀浆提取刺五加根茎原料中紫丁香苷、刺五加苷E和异秦皮啶等主要酚苷及苷元成分进行了优化。考察了匀浆提取时间、乙醇体积分数、匀浆转数和液料比等因素对提取工艺的影响，应用了Box-Behnken的实验设计，选取了3种目标产物的得率与纯度作为响应值。响应面法优化后提取工艺条件为提取时间4.04 min、乙醇体积分数59.66%、匀浆转数11 999.6 r/min、液料比7.96∶1 mL/g、提取次数3次。在所确定的工艺条件下，刺五加紫丁香苷得率0.0016%，纯度0.052%；异秦皮啶得率0.018%，纯度0.68%；刺五加苷E得率0.035%，纯度1.10%。

紫丁香苷；刺五加苷E；异秦皮啶；匀浆提取

在我国，刺五加 [Acanthopanax senticosus（Rupr. et Maxim.）Harms. Syn.Eleutherococccus Senticosus（Rupr. et Maxim.）Maxim]主要分布在东北及河北等地。刺五加活性成分的提取研究主要是采用水提[1]，甲醇[2]、乙醇回流提取[3－5]和超临界CO2萃取法[6]等。水提、乙醇回流提取，活性成分得率低；超临界CO2萃取选择性强，有效成分得率高[6]，但受处理量的限制，产量低，目前工业开发难度较大。现代药理学研究表明，刺五加的主要功效成分为酚苷及其某些苷元类成分，主要包括紫丁香苷、刺五加苷E和异秦皮啶 [分别见图1(a)、(b)、(c)]等。紫丁香苷具有抗疲劳[7]、增强免疫力[8]、护肝[9]和释放乙酰胆碱，增加胰岛素分泌[10]等作用；刺五加苷E具有缓解压力、抗焦虑[11]、抗应激、抗溃疡和抗疲劳[12]等作用；异秦皮啶是刺五加苷B1的苷元，具有明显的抗炎[13]和抗菌[14]作用。2005年版《中国药典》仅规定以紫丁香苷为定量指标，以异秦皮啶为定性指标，而刺五加苷E则为某些厂家提取物产品出口的指标。但仅以单一成分为衡量指标难以保证刺五加的全部功效成分得到充分的提取分离和利用。因此，寻找更加有效的提取刺五加功效成分的方法具有现实意义。

匀浆提取法是近年来发展起来的新型提取技术，匀浆提取是指生物组织通过加入溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取活体组织中有效成分的一种提取方法。该方法一般应用于从动物组织中提取氨基酸、蛋白质等目的成分[15－17]，近年来祖元刚等将植物组织应用匀浆提取法对萜烯醇、黄酮类物质进行提取，收到了很好的效果[18－19]。应用匀浆法提取植物活性成分，可以直接将物料置于匀浆机内，与提取溶剂在匀浆装置中混合匀浆，通过机械及液力剪切作用将物料撕裂和粉碎，使物料破碎和有效成分的提取同步进行，达到对植物有效成分快速、强化提取的目的。匀浆提取法提取速度快，温度低，能耗低，目的成分得率高。本研究利用匀浆法以紫丁香苷、刺五加苷E和异秦皮啶为指标成分，同时以各指标成分的得率和纯度为响应因子对刺五加中主要成分进行了提取，在单因素实验的基础上对匀浆提取过程中的各因素采用响应面法（response surface analysis methodology，RSA）进行了优化，取得满意结果，为规模生产提供了有价值的工艺参数。

图1 刺五加主要成分的结构

1 仪器与材料

1.1 实验仪器

JJ-2B型组织捣碎匀浆机，购自金坛市荣华仪器制造有限公司；BS-124S电子天平，购自北京赛多利斯仪器系统有限公司；3K30型离心机，美国SIGMA公司产品；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，购自上海亚荣生化仪器厂；717型自动进样高效液相色谱仪，包括1525二元泵和2487型紫外光检测器，美国WATERS公司产品。

1.2 实验材料和试剂

刺五加药材购于黑龙江省哈尔滨市三棵树药材市场，经东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室聂绍荃教授鉴定为刺五加的干燥根茎，用前粉碎成小块状。紫丁香苷（111574-200201）、刺五加苷E（11173-200501）和异秦皮啶（110837-200304）对照品购自中国药品生物制品检定所；含量测定用乙腈、甲醇为色谱纯，购自J&K CHEMICAL LTD.公司；色谱分析用二次蒸馏水自制，其它试剂均为国产分析纯。

2 试验方法

2.1 分析方法

2.1.1 高效液相色谱定量测定条件

采用高效液相色谱法：色谱柱为Kromasil C18（5 µm，4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸（15∶85，体积比）；流速mL/min；进样量10 µL；柱温25 ℃；检测波长205 nm。

2.1.2 标准曲线的绘制

分别精密称取紫丁香苷对照品9.84 mg，刺五加苷E对照品10.12 mg，异秦皮啶对照品10.16 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作为刺五加对照品储备液。分别精密量取2.0 mL、1.0 mL、0.5 mL、0.1 mL、0.05 mL、0.025 mL和0.01 mL对照品储备液，用甲醇分别定容至2 mL，分别标为1～7号对照品溶液。均进样10 µL，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线的方程如表1。

2.1.3 样品中紫丁香苷、刺五加苷E和异秦皮啶的含量测定

提取液稀释至适宜的检测浓度后离心（离心条件：温度25 ℃；速度12 000 r/min；时间5 min），取上清液进行HPLC检测，每样重复进样3次，将峰面积取平均值，代入回归方程，依式（1）计算各目的成分的得率，依式（2）计算各目的成分的纯度。

表1 标准曲线方程

式中，Y为得率，%；P为纯度，%；c为目的成分的浓度，µg/mL；V为提取液体积，mL；M为原料质量，g；m为浸膏质量，g。

2.2 影响提取工艺效果的因素试验

2.2.1 单因素试验

（1）匀浆提取时间

称取15.0 g/份粉碎后的刺五加根茎原料，15份，分为5组，每组3份，液料比为10∶1，在15份中分别加入体积分数为60%的乙醇溶液，选择不同的匀浆时间（1 min、2 min、3 min、4和5 min），用匀浆机以10 000 r/min转数进行匀浆，滤液取1 mL用于含量测定，其余减压回收溶剂并于60 ℃减压干燥，计量浸膏重量，计算得率和纯度。

（2）乙醇体积分数

称取15.0 g/份粉碎后的刺五加根茎原料，27份，分为9组，每组3份，液料比为10∶1，在27份中分别加入体积分数分别为0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%和80%的乙醇溶液，10 000 r/min匀浆提取4 min，其余操作同（1）。

（3）匀浆转数

称取15.0 g/份粉碎后的刺五加根茎原料，15份，分为5组，每组3份，液料比为10∶1，加入体积分数60%的乙醇溶液，分别以8000 r/min、9000 r/min、10 000 r/min、11 000 r/min和12 000 r/min提取4 min，其余操作同（1）。

（4）液料比

称取15.0 g/份粉碎后的刺五加根茎原料24份，分为8组，每组3份，分别按不同的液料比（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1和12∶1， mL/g）加入体积分数60%乙醇以10 000 r/min匀浆提取4 min，其余操作同（1）。

（5）提取次数

分别称取15.0 g/份粉碎后的刺五加根茎原料，按液料比10∶1 mL/g加入体积分数60%的乙醇溶液，以10 000 r/min转数提取4 min，将每次提取液过滤，滤饼再加入相同溶剂重复上述提取过程1～4次，每次滤液取1 mL用于含量测定，其余滤液合并后减压回收溶剂并于60 ℃减压干燥，其余操作同（1）。

2.2.2 工艺优化实验

根据单因素实验结果，由于提取次数对目标产物的影响已很明确，即提取次数越多，得率越大，因此提取次数不作为响应面法设计的主要因素。刺五加匀浆提取过程的主要影响因素包括：乙醇体积分数、提取时间、匀浆转数和液料比。以上述主要影响因素作为考察对象，采用Design Expert 7.0统计分析软件的响应面分析法分别以3种目标产物得率与纯度为响应值，进行响应面分析实验，以获取最适工艺参数。试验因素和水平安排见表2。

表2 响应面法分析的因子和水平

对紫丁香苷、刺五加苷E和异秦皮啶的得率和纯度的匀浆提取条件进行综合优化，得出结论。

3 结果与讨论

3.1 单因素对提取效果的影响

3.1.1 匀浆时间

由图2可以看出，随着匀浆时间的增加，得率呈递增趋势但在4 min后变化趋势并不明显，而纯度呈递减趋势。史权[15]在研究提到匀浆萃取工艺过程中指出匀浆作用是在最短的时间内将药材与溶剂充分溶合，使溶剂进入药材，将有效成分从固相转移到液相，使物料中的有效成分与溶剂中的浓度趋于平衡。因而，在此可认为在匀浆时间4 min时溶液中各有效成分已经趋于平衡状态，提取4 min后得率无明显变化。进一步延长匀浆时间，某些本不易溶出的杂质成分也被溶剂溶出，故随提取时间增加其纯度存在递减趋势。因此选择匀浆时间3～5 min为待进一步优化范围。

图2 匀浆时间的影响

3.1.2 乙醇体积分数

由图3可以看出，随着乙醇体积分数（φ乙醇）的增加，异秦皮啶在φ乙醇＞60%后得率明显下降，而紫丁香苷与刺五加苷E的得率在φ乙醇＞20%后就呈现下降趋势。目标产物纯度均在φ乙醇＞60%后呈现下降趋势。说明较高的乙醇体积分数使更多的杂质也同时被提取出来，是导致相应纯度的下降的原因。相对而言，异秦皮啶的药理作用最强[6]，3种成分在同时提取过程中的行为相异时，以异秦皮啶为主，以保证提取物具更全面的药效。因此选择φ乙醇50%～70%为进一步考察优化范围。

3.1.3 匀浆转数

由图4可以看出，随着匀浆转数的增加， 紫丁香苷与刺五加苷E得率、纯度呈递增趋势；但其中异秦皮啶在大于10 000 r/min后得率、纯度明显下降。由于芳香基有较强的吸电子能力，而氧离子是带负电的，由于苯环上的吸电子作用，使异秦皮啶中氧原子的电子向芳香基移动，芳基氧上的电子云密度减小，吸引力减弱，导致异秦皮啶的结构不稳定。因此当匀浆转数超过10 000 r/min时，由于匀浆机铰刀的快速剪切作用产生热效应使异秦皮啶的结构遭到破坏，从而表现出随匀浆转数增加，异秦皮啶的得率与纯度下降的状况。因此选取匀浆转数在9000～11 000 r/min之间进行优化设计。

图3 乙醇体积分数的影响

图4 匀浆转数的影响

3.1.4 匀浆次数

由图5可以看出，随着次数的增加，得率呈略微递增趋势。作者将4次提取的回收率设定为100%，各成分前3次的回收率均可达到90%以上。而纯度无明显变化。本着节约成本的原则，选择匀浆提取3次作为提取刺五加目的物质的条件。

图5 提取次数的影响

3.1.5 液料比

由图6可以看出，液料比为8∶1 mL时，3种目标产物得率与纯度达到最大值。祖元刚等[18]采用匀浆法研究烟叶中茄尼醇提取时发现当液料比过小时，其所能溶解的有效成分有限，但溶剂过多时物料与匀浆刀接触的概率减少，不能充分破碎物料，从而细胞内的有效成分不能充分溶出。因此，为了进一步明确液料比对刺五加有效成分提取的影响，选取液料比在(7∶1)～(9∶1) mL/g之间进行优化设计。

3.2 刺五加功效成分匀浆提取条件优化

RSA 试验设计组合和3种目标产物的得率与纯度见表2，RSA 试验设计组合和茄尼醇皂化的响应面试验中，29个试验点可以分为两类：其一是析因点，自变量取值在A、B、C、D 所构成的三维顶点，共有24 个析因点；其二是零点，为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。RSA 试验设计与试验结果见表3。

图6 液料比的影响

以3种目标产物的得率与纯度为响应值，经回归拟合后，根据Box-Behnken设计中ANOVA分析，各实验模型均显著，同时，失拟情况均为不显著，这表明试验所模拟的模型可用。

在模型中，当p值小于0.05时表明该模型项为显著因素。因此，通过表4可知，对异秦皮啶得率影响显著的因素有：一次项C和二次项A2、B2和D2；对异秦皮啶纯度影响显著的因素有：一次项C和二次项A2、B2和 D2；对紫丁香苷得率影响显著的因素有：一次项C和二次项A2、B2和 D2；对紫丁香苷纯度影响显著的因素有：一次项D和二次项AD、A2、B2和 D2；对刺五加苷E得率影响显著的因素有：二次项A2、B2和 D2；对刺五加苷E纯度影响显著的因素有：二次项A2、B2和 D2。其中乙醇体积分数和液料比的交互作用对紫丁香苷纯度影响显著，见图7。

表3 Box-Behnken实验设计方案及实验结果

表4 各响应值的回归分析结果的p值

图7 乙醇体积分数和液料比对紫丁香苷纯度影响的响应面和等高线

应用Design Expert 7.0中Box-Behnken中Optimization Choises的Numerical Optimization对3种目标产物的得率与纯度进行最优化（maximize）设计。得到在同一提取条件下，3种目标产物的得率及纯度最佳的提取工艺条件：液料比7.96∶1 mL/g，乙醇体积分数59.66%，匀浆时间4.04 min，匀浆转数11 999.6 r/min，提取次数3次。3种目标产物的得率及纯度分别为：异秦皮啶得率0.018%、异秦皮啶纯度0.69%、紫丁香苷得率0.001 86%、紫丁香苷纯度0.0578%、刺五加苷E得率0.036%和刺五加苷E纯度1.14%，其合意性（desirability）为0.864。而3种目标产物的得率及纯度的综合影响的合意性，可见图8。

3.3 最佳条件的验证实验

取15.0 g粉碎的刺五加根茎原料（绝干计）装入匀浆机中，在最佳匀浆条件下提取，重复实验3次取平均值，验证实验结果。紫丁香苷得率为0.0016%，纯度0.052%，与理论值分别相差0.000 3%（绝对值，下同）和0.004%；刺五加苷E得率为0.035%，纯度1.10%，与理论值分别相差0.001%和0.04%；异秦皮啶得率为0.018%，纯度0.68%，与理论值分别相差0.000%和0.01%。

图8 各因素对目标产物的得率与纯度的合意性的响应面和等高线

4 结 论

采用匀浆法以异秦皮啶、紫丁香苷和刺五加苷E为指标成分，同时以各指标成分的总得率和纯度为响应因子对刺五加中的主要功效成分进行了提取，在单因素实验的基础上对匀浆提取过程中的各因素采用响应面法进行了优化，得到刺五加的最佳匀浆提取工艺条件为：乙醇体积分数59.66%、液料比7.96∶1 mL/g 、提取时间4.04 min、匀浆转数11 999.6 r/min、提取次数3次。最佳条件下的验证实验表明：刺五加紫丁香苷得率可达0.0019%，纯度0.058%；异秦皮啶得率可达0.018%，纯度0.69%；刺五加苷E得率可达0.036%，纯度1.14%。

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Optimization of homogenized extraction of phenol glycosides and aglycones from the root of acanthopanax senticosus harms using response surface analysis

LIU Yang，YANG Lei，HAO Jingwei，ZU Yuangang
（Key Laboratory of Forest Plant Ecology of Northeast Forestry University，Ministry of Education，Harbin 150040，Heilongjiang，China）

Response surface methodology（RSM）was used to optimize the process of homogenized extraction of five main phenol glycosides and aglycones（target products）from the root of Acanthopanax senticosus（Rupr. Et Maxim.）Harms. According to Box-Behnken experiment design，four independent variables were selected，i.e. ethanol volume fraction，extracting time，homogenization power and liquid to solid ratio，to investigate the influence on extraction efficiency. Meanwhile，extraction rate and the purity of three target products were chosen as responses. The optimal parameters were obtained as：extraction time of 4.04min，ethanol volume fraction of 59.66%，homogenization velocity of 11 999.6 r/min，liquid to solid ratio of 7.96∶1 mL/g and 3 times. Under the optimized condition，the extraction rate and purity of three target products were found as 0.001 6% and 0.052% for syringin，0.018% and 0.68% for isofraxidin，0.035% and 1.10% for eleutheroside E，respectively.

syringin；eleutheroside E；isofraxidin；homogenized extraction

TQ 460.6

A

1000–6613（2010）04–0745–08

2009-10-23；修改稿日期：2009-12-27。

国家科技支撑计划项目（2006BAD18B04）。

刘洋（1984—），男，硕士研究生。联系人：祖元刚，教授，博士，博士生导师，从事植物化学和植物药研发。E-mail zygorl@126.com。