微生物分子生态学技术及其在石油污染土壤修复中的应用现状与展望

吴作军，卢滇楠，张敏莲，刘 铮

（清华大学化学工程系，北京 100084）

特约评述

微生物分子生态学技术及其在石油污染土壤修复中的应用现状与展望

吴作军，卢滇楠，张敏莲，刘 铮

（清华大学化学工程系，北京 100084）

概述了微生物分子生态学技术的原理及在土壤生物修复中的应用。该技术可以提供土壤微生物群落多样性信息，跟踪降解菌株（群）的定植及发挥作用的过程，展现投加菌株与土著菌群相互作用的信息，为生物修复中降解菌的筛选、修复过程的强化及修复结果的评估提供生物学信息。展望了该技术在土壤生物修复中应用的前景。

土壤生物修复；分子生态学；微生物分子生态学；分子生物学

分子生态学这一概念首先见诸于《Molecular Ecology》发刊词[1]，它是以分子生物学技术为工具来研究特定环境中的微生物区系组成、结构、功能、适应性发展及其分子机制等，从遗传、种类和生态系统层次上揭示微生物群落演变的规律，反映生态环境和外界胁迫对微生物群落的影响[2－4]。20世纪70年代以前，微生物多样性的研究主要采用分离培养方法，依据形态学、生长特征、生理生化特性进行分类。此类方法无法反映出占土壤微生物中绝大多数的未培养微生物的信息，所得到的环境微生物群落多样性是不全面的。20世纪70～80年代生物标记技术的发展，提高了对于环境微生物群落多样性的分析精度。80～90年代，现代分子生物学技术的引入，可直接给出环境中微生物的遗传信息，提供土著微生物组成和结构依据。

正如Vogel和Walter[5]所指出的那样：“微生物生态学问题是生物修复技术中最重要的部分。”解析特定环境中的微生物群落结构可直接展示环境体系生态功能特性、修复过程中微生物群落演变以及投加菌株的定植情况，为生物修复过程中优化微生物群落结构、筛选高效降解菌株、协调微生物群落功能和确定工程实施方案提供依据，并可用于评估生物修复的效果。微生物分子生态学为土壤生物修复的基础创新和工程应用提供了有力的基础科学工具。

1 土壤生物修复技术研究现状

土壤生物修复是利用微生物及其它生物去除存在于土壤和地下水体中的有毒有害污染物，或将其转化成无害化物质的技术和方法。根据微生物来源及施加方式划分，主要分为自然衰减技术（natural attenuation），生物强化技术（bioaugmentation）和生物刺激技术（biostimulation）。生物修复技术是修复石油污染耕地的有效措施，被美国国家环保局（USEPA）推荐作为原油污染土壤修复的首选措施。表1总结了上述生物修复技术的主要特征。

表1 生物修复技术的分类以及主要特点

我国目前对石油污染土壤生物修复技术研究主要集中于高效降解菌株（群）的筛选及特性研究和生物修复实施方法的改进两个方面[6－7]。中科院沈阳应用生态研究所孙铁珩等[8－18]筛选了多株具有高降解活性的微生物，在真菌对石油化合物的降解行为进行了深入研究。南开大学周启星等[19－20]对石油污染土壤的植物修复、微生物-植物复合修复方面进行了系统的研究工作，采用蚯蚓对已修复的土壤的生物毒性进行检测。南京土壤研究所的骆永明等[21－23]利用微生物培养、碳素利用法（Biolog）和发光细菌生物毒性测定对污染土壤的微生物数量和多样性进行分析。清华大学刘铮等提出了土壤环流诱导驯化筛选方法并得到了多株石油烃降解菌；研制出固态大孔微生物制剂[24]，采用低温等离子体诱变技术得到耐盐阴沟肠杆菌[25]；提出并实现了真菌-细菌协同原位降解石油烃技术[26－27]及其与耕作层麦秸填埋发酵相结合的油-盐混合污染耕地原位修复技术[28－30]，将分子生态学技术应用于监控和强化生物修复过程。该研究团队2006年在中原油田（河南濮阳）完成了面积为11亩的石油污染耕地的现场修复，修复地块小麦产量达到正常耕地的70%，品质符合国家规定，授权和公开专利7项[31－37]。

2 分子生态学技术在土壤修复中的应用

2.1 微生物分子生态学分析技术概述

现代微生物分子生态学技术主要分为基于PCR扩增和不基于PCR扩增的分析技术。基于PCR扩增的技术根据分析目标种群DNA片段的不同又可以分为以一段特定种群DNA片段为研究对象的种群DNA片段分析技术（partial community DNA analysis）和以全部种群DNA为研究对象的全种群DNA分析技术（whole community DNA analysis）[38]。其中种群DNA片段分析技术又包括PCR片段克隆测序技术和基因图谱技术，PCR片段克隆测序技术主要用于分析不同地理位置，耕作模式和理化性质土壤之间的微生物种群多样性[39]。此方法操作复杂、耗时且克隆选择数目对微生物多样性分析的全面性有较大影响。基因图谱技术是目前微生物分子生态学分析广泛采用的一类分析技术，包括变性/温度梯度凝胶电泳技术（DGGE/TGGE）[40]、扩增核糖体DNA片段限制性分析（ARDRA）[41]、末端限制性酶切片段长度多样性分析（T-RFLP）[42]、核糖体基因间序列分析（RISA）[43]和随机扩增DNA片段多样性（RAPD）[44]。与PCR片段克隆测序技术相比，基因图谱技术更适宜于微生物组成更为复杂的环境样品，且操作更为便捷。基于PCR扩增的分析方法由于其中包括了对目的样品的DNA片段的PCR扩增过程，所以PCR的扩增效率是这类技术成败的关键因素。表2中列出了目前常用的基于PCR的微生物分子生态学分析技术。

在不依赖于PCR的微生物分子生态学研究方法中，应用最为广泛的是荧光原位杂交（FISH）分析技术，此外还有荧光染色计数技术、微生物理化性质检测鉴定技术、磷脂脂肪酸分析技术等。这类技术主要依靠微生物本身细胞组成和生长特性的不同进行分析，与基于PCR的分子生态学分析技术相比，存在一定的不足，例如不能提供详细的微生物群落信息或特定菌株（群）的生长信息等，但二者可结合使用，得到更全面和准确的微生物群落结构信息。

表2 常用的微生物分子生态学技术一览表

2.2 微生物分子生态学技术在土壤修复过程中的应用

2.2.1 变性/温度梯度凝胶电泳技术（DGGE/TGGE）DGGE/TGGE最早是一种应用于检测DNA的点突变的电泳技术[45]，根据变性梯度和电场方向不同，分为垂直梯度电泳和平行梯度电泳。垂直梯度电泳中变性剂/温度梯度方向与电场方向相垂直，可以具有较大的梯度应用范围，较多地应用于DNA突变的筛选；平行梯度电泳中变性剂/温度梯度方向与电场方向相平行，变性剂/温度梯度范围相对较窄，但是具有更高的分离精度，可以较好地满足微生物多样性分析的要求。自1993年Muyzer等[40]首次将DGGE应用于土壤微生物生态学领域以来，这项技术已应用于土壤、根系、沙丘、高温热泉、湖泊、长江、海洋、水体、发酵食品等环境微生物群体多样性的研究和微生物群体动态的追踪研究上。

Wilfred等[46]将DGGE用于石油污染土壤的原位修复过程研究中，在为期1年的场地试验中采用该技术跟踪土壤菌群变化，发现虽然石油烃降解效率随着时间的增加而增加，但是菌落结构在不同时间和不同处理中并没有较明显的变化。Marc Vinas等[47]将PCR-DGGE和主成分分析相结合对杂酚油污染土壤的实验室修复过程中细菌群落变化的动力学以及对多环芳烃的降解特性进行了研究，发现在修复早期α-Proteobacteria纲在所有处理中都占有优势，后期γ-Proteobacteria纲、α-Proteobacteria纲和Cytopage-Flexibacter-Bacteroides纲在未添加营养的处理中占优势，而γ-Proteobacteria纲、β-Proteobacteria纲和α-Proteobacteria纲在添加营养的处理中占优势，说明特定的细菌类型既与不同的生物修复阶段有关，也与污染土壤中营养的添加与否有关。Li等[48]研究了石油污染土壤中的细菌多样性和土壤酶活性变化。实验样品的石油烃含量从277.11 mg/(kg土)到5213.37 mg/(kg土)，结果表明，随着石油烃浓度增加，细菌多样性和土壤脱氢酶活也有一定的增加。Michael等[49]从多环芳烃（PAH）污染土壤中分离得到一株可以降解PAH的鞘脂菌属（Sphingobium sp.）细菌B1，DGGE发现投加菌株明显影响土著菌群的组成，并且在土著菌群中具有降解特性的菌群占据数量的多数。Nuria等[50]在治理西班牙北海岸石油污染沙滩时，采用DGGE分析表明细菌群落主要为α-Proteobacteria纲、γ-Proteobacteria纲和Bacteroides纲也同时存在，但是数量相对较少。Li等[51]在110 天的试验室模拟试验中，采用DGGE对煤油污染土壤的生物修复过程中的群落结构变化进行了动态监测，并将DGGE技术与微生物培养技术、土壤微生物酶活测定等技术相结合。结果表明，在煤油污染土壤的生物修复中α亚种中的Sphingomonadaceae菌科变化较大，可以作为煤油污染土壤修复中的指示剂。Coppotelli等[52]采用DGGE技术研究了由菲污染土壤中分离得到的菌株Sphingomonas paucimobilis 20006FA对菲污染土壤中菌群变化的影响。结果表明，该菌株可以较好降解土壤中的菲，并且促进土壤土著微生物的生长，特别是菲利用菌株的生长。

将DGGE与TGGE结合可以给出特定环境体系的微生物组成结构信息，有助于分离和驯化高效的污染物降解菌株。Smalla等[53]利用DGGE/TGGE分析了马铃薯根系土壤的微生物组成，通过特定的营养条件驯化出两种不同的菌群，这两种菌群对植物根系的营养转换起到了关键作用，显示出DGGE/TGGE指导菌株分离的可能性。Wawer等[54]利用DGGE技术对硫酸盐还原菌群Desulfovibrio中的脱氢酶基因的多样性进行分析，说明了不同的Desulfovibrio菌种在环境中的组成和分布情况。随着功能基因序列信息越来越完整，采用PCR-DGGE/TGGE的方法通过对功能基因的多样性分析也是了解特定环境体系中功能微生物群落结构的一种方法。

2.2.2 末端限制性长度多样性技术（T-RFLP）

限制性内切酶和荧光标记引物PCR技术的发展为T-RFLP奠定了基础。Cancilla等[55]首次采用荧光标记引物进行PCR扩增基因外重复回文序列，对Lactococcus lactis 菌株的基因图谱进行分析，形成了荧光加强的重复回文序列PCR技术（FERP）。Avaniss-Aghajani等[56]首次利用了荧光标记的引物扩增了16S rDNA序列，形成了快速准确的广谱细菌群落分析技术。T-RFLP技术融上述两种技术于一体，其原理是根据微生物16S rDNA两端的保守区设计通用引物，其中一个引物的5’端用荧光物质进行标记，常用的荧光物质有HEX、6-FAM等。所得到的5’端荧光标记的PCR产物，进行限制性酶切反应，根据限制性酶切位点的差异，酶切后获得长短不一的限制性片段，这些末端带有荧光标记的限制性片段用自动测序仪进行检测。由于不同长度的末端限制性片段代表不同的微生物，而且相同长度的末端限制性片段代表至少一种微生物的存在，所以这些末端标记的片段可以用来反映微生物菌落的组成情况[57－60]。

Liu等[57]最早将T-RFLP技术应用于土壤微生物群落组成结构的分析。Katsivela等[61]利用T-RFLP技术对石油污染土壤原位修复的微生物群落结构和数量的变化情况进行了分析，在14个月的修复过程中，土壤中正构烷烃降解率可以达到75%～100%，石油降解菌群数量居土著微生物中主导地位，与不添加石油降解菌株的处理相比，石油烃的降解效率显著提高。Denaro等[62]利用T-RFLP技术检测了3个石油烃污染水体的细菌群落分布，分析了3个月内的细菌群落多样性的变化情况，结果表明限制性末端数量占优势的菌群是石油烃降解菌群，在生物修复不同阶段中，细菌菌群变化较明显。

T-RFLP技术具有比电泳为基础的群落分析方法（ARDRA）更好的灵敏度和准确性，但由于T-RFLP难以像DGGE/TGGE技术那样提供详细的序列信息，所以在微生物组成分析方面存在缺陷。但T-RFLP技术因其荧光标记的灵敏性，是监控环境体系中特定微生物如污染物降解菌群的生长的高效工具。

2.2.3 其它方法

微生物多样性的分析检测方法仍然在发展中，目前出现的新技术可归纳为三大类。

第一类是基于PCR的方法。例如核糖体基因间序列分析（RISA）、随机扩增DNA片段多样性（RAPD）和实时荧光定量PCR技术等。RISA原理在于选择了微生物rrs和rrl基因之间的一段间隔序列（IGS）作为分析对象，得到关于这段序列的相关信息，对多样性进行分析，但是由于该段序列的信息远远不如16S rDNA序列信息丰富，所以对该技术的广泛应用有所抑制。RAPD主要是利用合成的10 bp小引物进行随机结合扩增，产生的PCR产物通过电泳检测具有不同的条带信息，但是这种技术的重复性相对较差，并且这种技术不能提供详细的种群信息，对于微生物组成的分析显然是不够的。实时荧光定量PCR保留了PCR技术的敏感性和特异性，可以通过光电传导系统实时原位和定量检测PCR扩增，汇集了DNA杂交的高特异性和光谱的高灵敏性[63]。

第二类是不依赖PCR的技术。例如荧光染色计数技术[64]可以快速、简便计量活菌和死菌的数量，采用不同染料即可在荧光检测器下进行活菌或死菌计数。荧光原位杂交技术可以直接鉴定以及定量分析样品中的特定的微生物或者是分类群[65]。该方法中被研究的微生物细胞被固定，其原理是利用荧光标记的特异核酸探针与环境样品内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交，通过荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布[66－67]，或者结合了荧光探针的DNA区域或RNA分子在染色体或其它细胞器中的定位。

第三类是基于生物细胞内特征物质来分析微生物多样性，利用这些特征性物质可以在属甚至种的水平上对微生物生态状况进行分析。磷脂脂肪酸谱图分析、脂肪酸谱图分析、甲基脂肪酸图谱分析、生物醌图谱分析等，这些方法也可用于群落动态分析。

综上所述，分子生态技术作为一种有效的生物监控手段，直接反映了微生物菌株定植、菌群的动态变化等，是修复过程监测和结果评估的科学工具，也为修复过程优化的提供了重要依据。

3 微生物分子生态学在土壤生物修复中应用展望

土壤修复作为环保产业的组成部分，其发展首先受到国家的经济和社会建设需求的牵引。据预测，我国的环保产业市场规模将从1995年的29亿美元扩展到2010年的130亿美元。在此之前，我国环保领域的污染物处理产业主要集中于污水处理、废弃物管理和空气污染治理。伴随着新一轮经济增长，工业化和城镇化步伐加快，我国面临的土地紧张矛盾将更加突出，而全社会科学水平和环境意识的提高，将促使人们更加注重并追求生产和生活环境的安全，更加关注地下水体、耕地、厂区、居民区的土地安全问题。这些都为土壤修复产业的发展提供了巨大的需求牵引力。

与之对应，污染土壤的修复得到了我国政府和学术界的高度重视，“十一五”期间科技部启动了土壤生物修复的系列重点项目。中国科学院完成的“中国2050年生物质资源科技发展路线图”中也将土壤生物修复纳入到重要的战略目标中，其重要性不言自明——没有优质土壤作为基础，基于生物质的资源和能源的生产和转化只能是梦想。

当前我国污染土壤的生物修复技术研究方兴未艾，但也面临着严峻的挑战。要推进我国土壤修复这一关乎国计民生的事业和产业的发展，需要先进的科学技术和严格的环保法规体系“双轮驱动”。在科学技术领域，当前需要解决的问题主要是以下几个方面。

（1）提高土壤修复研究的科技水平。土壤组成复杂、组分间相互作用（物理、化学、生物）复杂、修复过程呈现开放体系特性，这对于揭示修复过程的微观机理提出了特殊的挑战。如果研究工作只是停留在宏观表象层面，则研究成果的可推广性会受到严重影响，导致在修复技术研发方面的“重复投资”。而要解决上述问题，需要引入更为先进的概念和工具。本文所介绍的微生物分子生态学就有望全面展现参与石油污染物降解的微生物群体的整体全貌及其演变规律，而这是采用传统的培养法所难以实现的。

（2）需要建立全面的土壤修复标准，推进依法理赔、依法复耕。事实上，修复标准的内容和方法也是科技进步的综合体现。我国当前耕地土壤污染程度或者修复效果评估尚完全依据的是化学组分分析，而赔偿标准则多是基于粮食产量的受损情况。上述方法的待改进之处在于：化学分析方法反映的是单一有毒有害成分的去除情况，而以产量定赔付具有人为干预性，也影响到了农民修复土地上进行复耕的积极性。从科学内涵上分析：上述指标均难以直接衡量或者反映土壤涵养生物和生命过程的能力——耕地最重要的功能。因此，应当将微生态指标体系引入到耕地污染和修复评估体系中，以反映耕地最重要的本征功能——参与生命活动的种群（功能基因）的数量和组成。

（3）环保法规的建设和实施。依法推进污染土壤的修复和修复后耕地的复耕是保护国家土地和耕地资源的基本措施，也是推进土壤修复产业发展和技术进步的法律动力。

土壤微生物在众多生命活动中起着至关重要的作用，采用微生物分子生态学的方法可以从基因层面上深入解析土壤宏观微生物和功能微生物种群的组成和数量，用以反映土壤的生物学特性，为生物修复的评估提供重要的、客观的、全面的指标。促进分子生态学在土壤修复领域中的应用将为加速我国污染土壤的修复、保障国家珍贵的土地资源、实施生物质资源路线、最终实现可持续发展等提供科技动力。

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Progress in applications of microbiological molecular ecology in bioremediation of petroleum contaminated soil

WU Zuojun，LU Diannan，ZHANG Minlian，LIU Zheng
（Department of Chemical Engineering，Tsinghua University，Beijing 100084，China）

This review starts with a brief introduction on principles and methods of microbiological molecular ecology as well as their applications in soil remediation. In addition to the genetic information of soil microbial community，the use of microbial molecular ecological tools enables the monitoring of the growth and function of inoculant degrading microbials，as well as their interaction with the indigenous microorganisms. These information are of fundamental importance for the selection and screening of degradation microbial communities，the intensification of degradation process，and the evaluation of remediated soil. Application perspective of microbiological molecular ecology is also discussed.

soil bioremediation；molecular ecology；microbial molecular ecology；molecular biology

TQ 033

A

1000-6613（2010）05-0789-07

2010-01-11；修改稿日期：2010-03-19。

吴作军（1982—），男，锡伯族，博士研究生。联系人：刘铮，教授，博士生导师。电话 010-62799876；E-mail liuzheng@mail.tsinghua.edu.cn。