碘量法对乳制品中β-内酰胺酶的检测

谢岩黎，张鑫潇，严瑞东，王金水

（河南工业大学粮油食品学院，郑州450052）

碘量法对乳制品中β-内酰胺酶的检测

谢岩黎，张鑫潇，严瑞东，王金水

（河南工业大学粮油食品学院，郑州450052）

检测β-内酰胺酶分解β-内酰胺类抗生素所生成的物质，间接判断牛奶中是否有β-内酰胺酶残留。采用碘量法对牛奶中的β-内酰胺酶定性、定量分析，结果表明，当酶浓度大于30 U/mL时，可以用直接碘量法对其进行定性分析，可用间接滴定法对其进行定量分析。

乳制品；β-内酰胺酶；碘量法

0 引言

青霉素在β-内酰胺酶作用下，酶中亲核性基团向β-内酰胺环进攻，开环后可脱羧重排生成中间体青霉噻唑酸[1，2]。以青霉素为代表的β-内酰胺类抗生素过敏反应非常普遍，引起过敏反应的基本物质有两种，一种是青霉素裂解生成一些青霉噻唑酸，与蛋白质结合形成抗原而致敏。另一种过敏源是一些高聚物，为β-内酰胺环开环后自身聚合而成，聚合程度越高，过敏反应越强。虽然由于添加β-内酰胺酶造成青霉素过敏的病例并未被研究证明，但根据青霉素的过敏机理，以及β-内酰胺酶的添加可能会造成β-内酰胺类抗生素耐药性的原因，确实应该对β-内酰胺酶的滥加提高警惕，严加管理。为了广大消费者的身体健康，维护乳制品市场良好的竞争环境，建立乳制品中β-内酰胺酶的快速检测方法是当务之急[3]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

β-内酰胺酶（3×106U/mL），青霉素钾标准品，兽药青霉素钾，碘化钾，碘，可溶性淀粉，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，硫代硫酸钠（分析纯），市售纯牛奶（242 mL）。

1.1.2 主要仪器

Agilent 6310 Ion Trap LC/MS，DK-S24型电热恒温水浴锅，DM-301型水浴恒温震荡器，7200型分光光度计，TDL-4型台式离心机，AL204型电子天平，雷磁PHS-3C型pH计，Proline移液枪。

1.2 分析方法

1.2.1 液质联用法检测分解产物

（1）液相条件。流动相为甲醇︰水=25︰75（体积比），流速为0.500 mL/min；DAO检测器，波长为230 nm，进样量为10.00 μL[4，5]。

（2）质谱条件。离子源为ESI(-)，雾化气压力为1.03 MPa，干燥气流速为7.0 L/min，干燥气温度为325℃[6，7]。

（3）样品处理。取约0.01 g青霉素钾标准品，置100 mL容量瓶中，加入1 mL β-内酰胺酶，再加入少量去离子水溶解稀释。室温条件下放置10 h，定容，混匀。取20 mL溶液，置离心管中，3 000 r/min离心30 min，0.45 μm过滤，进样量为10.00 μL。

1.2.2 碘量法

（1）直接碘量法定性分析。取6支试管，按顺序分别加入含有4 000 U/mL青霉素钾牛奶溶液1 mL,再依次加入1 mL的0，15，30，60，90，150 U/mL β-内酰胺酶，摇匀。0号管作为对照实验。在37℃恒温水浴40 min，取出后分别加入500 μL的1%的淀粉溶液，摇匀，再分别加入碘液20 μL，不断摇晃，在2 min内观察颜色变化[8]。

（2）间接碘量法定量分析。取6支100 mL的容量瓶，各加入100 mL的含β-内酰胺酶的牛奶溶液，再依次加入5，4，3，2，1，0 μL的β-内酰胺酶，摇晃均匀。放入37℃恒温水浴箱中60 min。取出后，从每个容量瓶中各取出10 mL的溶液分别放入离心瓶中，再各加入10 mL的甲醇，放入37℃振荡器中10 min，取出后在离心机（2 000 r/min）中离心20 min。离心后取出上清液各10 mL，分别放入标号1，2，3，4，5，6的锥形瓶中。然后各加入浓度为0.02 mol/L的碘液25 mL。用硫代硫酸钠溶液滴定，至滴定快到终点时加入淀粉指示剂，继续滴定至完全褪色时，记录所用体积[9，10]。

2 结果

2.1 液质联用法检测分解产物

图1为β-内酰胺酶分解青霉素产物质谱图。青霉素钾的分子量为372.49 u，由图1可以看出，373处的峰不明显，且m/z333和289未出现峰[11，12]，可以判断实验前处理中，β-内酰胺酶已经基本将青霉素钾完全分解。在负离子模式下去掉钾离子，青霉噻唑酸离子的结构如下。

分子量为351.49 u，丢失44分子量产生m/z307.0碎片离子，结合青霉噻唑酸结构图，断定为脱去COO-如下。

根据图1可以判断，青霉素在β-内酰胺酶的条件下分解产物为青霉噻唑酸。

图1 β-内酰胺酶分解青霉素产物质谱图

2.2 直接碘量法定性实验

表1为β-内酰胺酶的量对显色反应的影响。由表1可以看出，在37℃恒温水浴40 min的条件下，当β-内酰胺酶的浓度达到15 U/mL的时候，开始有显色反应，但是由于酶浓度比较低，产生的青霉噻唑酸量较少，加入碘液后，2 min内颜色没有完全褪去，在15 U/mL浓度左右，肉眼观察褪色程度比较困难，难以定性；在酶浓度达到30 U/mL的时候，2 min内颜色完全褪去，故碘量法定性的检测限为30 U/mL。

表1 β-内酰胺酶的量对显色反应的影响

2.3 间接碘量法定量实验

取6个不同的酶浓度，进行重复性实验，分析此实验的可操性。以酶浓度（mol/L）为横坐标，Na2S2O3平均体积为纵坐标，绘制β-内酰胺酶的标准曲线图，结果如图2所示。

图2 缓冲液中β-内酰胺酶的标准曲线（Ⅰ）

由于是在37℃下恒温水浴40 min，β-内酰胺酶在40 min是没有完全反应的[2]。由图2可以看出，30，60，90 120，150 U/mL5个浓度酶与空白相差较大，做出的曲线的相关性很差。考虑到β-内酰胺酶未反应完全，去掉空白后，做出5个浓度的酶的关系如图3所示。

图3 缓冲液中β-内酰胺酶的标准曲线（Ⅱ）

由图3可以看出，R2=0.9895，实验相关性很好。可以通过滴定法对缓冲液中的β-内酰胺酶进行定量测定。

3 结论

利用碘量法对牛奶中的β-内酰胺酶定性、定量，相较于微生物法、高效液相色谱法，该法具有方法简单、时间较短、容易操作等优势，适用于基层检测单位和现场初筛。当酶浓度大于30 U/mL时，可以用直接碘量法对其定性分析，用间接碘量滴定法对其定量分析，为碘量法测定β-内酰胺酶进一步的优化与研究提供和了参考的依据。

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Research on iodometric method detecting β-lactamase in milk

XIE Yan-li，ZHANG Xin-xiao，YAN Rui-dong，WANG Jin-shui
(School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450052，China)

It can make indirect judgement whether it has β-lactamase in the milk with detecting the decomposed product.The qualitative and quantitative analysis of β-lactamase by iodometric method.The results indicate that it can make qualitative and quantitative analysis of β-lactamase by direct and indirect iodimetric when the concentration of β-lactamase is more than 30 U/mL,respectively.

milk product；β-lactamase；iodometric method

TS252．7

A

1001-2230（2010）12-0036-02

2010-08-31

谢岩黎（1971-），女，副教授，从事食品营养与安全方面的研究。