精苓消瘤胶囊对Beagle犬的长期毒性研究

刘 悦,靳洪涛,李 偃,王爱平,黄明芳,魏金锋,张晶璇

(1.中国医学科学院北京协和医学院药物研究所新药安全评价研究中心,北京100050;2.西安新星医药研究所,西安710065)

手术、放射治疗和化学治疗是当前恶性肿瘤特别是实体瘤治疗的三大支柱,随着技术手段的不断更新,前两者的治疗潜力已达极限且多限于局部治疗,而且大多数化疗药物缺乏特异的选择性,在杀死癌细胞的同时,也会杀伤正常细胞,对人体造成一定的损伤[1],因此,保护正常组织免受化疗的损害从而减轻毒副作用,是提高肿瘤治疗效果的重要途径[2].从现代医学观点来看,扶正祛邪的根本目的在于改善和恢复机体神经―体液调节,增强免疫调节,从而杀死体内的恶性肿瘤细胞,手术、放疗、化疗虽然都是祛邪抗癌的有效手段,但着眼于消灭癌性病灶,势必会造成机体气血耗伤,脏腑功能紊乱失调,相反,中医着眼于整体,在祛邪抗癌同时给予扶正培本以达到攻补兼施[3-4].精苓消瘤胶囊是西安新星医药研究所研制的一种“扶正祛邪”类中药,主要用于抗肿瘤的治疗,该药能提高病人的生存质量,既能抑制肿瘤的生长又不破坏人体免疫系统.为了评价其安全性,进行了精苓消瘤胶囊长期给药对Beagle犬产生的毒性反应实验,观察了其毒性作用的靶器官及其损害的可逆性,确定了无毒反应剂量,为临床安全用药的剂量设计和临床毒副反应监测提供了参考资料[5].

1 实验材料

1.1 供试品

精苓消瘤胶囊,西安新星医药研究所提供,批号:20080201,固体,为棕褐色粉状颗粒.

1.2 动物

Beagle犬24只,雌雄各半,犬龄6～8个月,体重5～7 kg,由北京科宇动物养殖中心提供(动物许可证号:SCXK(京)2007-0003).动物饲养于普通环境设施内,由获得资格认可的人员饲养.设施保持连续通风,光照时间为7:30～19:30,室温18～24℃,湿度40%～70%.每笼饲养1只犬,由北京科澳协力饲料有限公司提供的标准膨化饲料喂养,每天上午和下午各150 g,自由摄食.

1.3 仪器

Vitalab SELECTRA-E全自动生化分析仪(荷兰);AVL-9181电解质分析仪(瑞士);NIKON KODEN 7222型五分类全自动血球计数仪(日本);STAGO STA-4型半自动四通道血液凝固分析仪(法国);泰利特GJ2-T-50尿十项分析仪(美国);联合MCS7200生物显微图像分析系统(美国);Leica ASP300封闭式全自动组织脱水机(德国);Leica EG1140型分体式组织包埋机(德国);Leica RM 2145型半自动轮转式切片机(德国);O-lympus荧光显微镜(日本)等.

2 实验方法

2.1 动物分组与给药

将Beagle犬按体重随机分成4组,每组6只,雌雄各半,设空白对照组,精苓消瘤胶囊高、中、低3个剂量组(1.50、0.60、0.25g/kg,分别相当于临床拟用剂量的20、8、3倍).每日上午8:30～12:00给药,每周给药6 d,周日不给药,持续180 d[6].

2.2 观察指标

每天观察犬的皮毛、运动、神态、呼吸、进食量、粪便、黏膜颜色等;每周测量1次犬的体重、体温;分别于给药前(2次)、给药后90、180 d和恢复期结束后检测犬的心电图、血液学指标及血液生化学指标,血液学指标包括:红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞压积容量(HCT)、红细胞平均体积(MCV)、平均血红蛋白量(MCH)、红细胞分布宽度-变异指数(RDWCV)、血小板总数(PLT)、血小板平均体积(MPV);血液生化学指标包括:丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLO)、总胆固醇(CHO);于给药后180 d和恢复期结束后膀胱取尿进行尿常规检查,其指标包括:葡萄糖(GLU)、胆红素(BIL)、酮体(KET)、潜血(BLO)、蛋白(PRO)、亚硝酸盐(NIT);于给药后180 d和恢复期结束后进行病理学检查,指标包括:系统尸检、脏器重量及脏器系数检查、组织病理学检查[7-8].

2.3 恢复期观察

末次给药后24 h后,每组剖杀雌雄动物各2只,其余动物继续观察6周后处死,以便了解毒性反应的恢复情况和可能出现的迟发性毒性.

3 实验结果

3.1 一般生理性指标观察

3.1.1 笼旁观察

各组犬外观体征、体表黏膜未见异常,行为活动正常,粪便正常.在实验期间无犬死亡.

3.1.2 体重、体温和食量

实验期间,各组犬体重逐步上升,精苓消瘤胶囊各剂量组与对照组相比,体重变化无显著性差异;各组犬体温变化也均在正常范围胶内;精苓消瘤囊各剂量组犬饲料消耗量与对照组相比也无显著性差异.

3.1.3 心电图检查

给药结束时,精苓消瘤胶囊0.60 g/kg组的心率低于对照组(125±19*↓,vs 150±19,次/min,*P＜0.05),1.50、0.60 g◦kg-1组的PR间期与对照组比较有统计学差异(0.056±0.005*↓、0.054±0.004*↓,vs 0.067±0.010,s,*P＜0.05),0.25g/kg组QRS间期与对照组比较有统计学差异(0.047±0.005*↓,vs 0.059±0.006,s,*P＜0.05),因为不具有剂量反应关系,故心率、QRS间期的改变没有毒理学意义.结合历史数据分析恢复期结束时各指标给药组与对照组比较均未见明显差别,见表1.

表1 精苓消瘤胶囊对Beag le犬心电图指标的影响

表1 精苓消瘤胶囊对Beag le犬心电图指标的影响

注:与对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01

组别 天数/d动物数/只 室率/(beats◦min-1)PR间期/s QRS间期/s QT间期/s对照组-7 6 121±21 0.114±0.017 0.072±0.013 0.207±0.016高剂量组-7 6 124±21 0.120±0.000 0.066±0.017 0.215±0.033中剂量组-7 6 119±29 0.111±0.014 0.073±0.042 0.207±0.016低剂量组-7 6 130±23 0.108±0.013 0.067±0.013 0.197±0.006对照组0 6 115±29 0.119±0.015 0.077±0.058 0.205±0.008高剂量组0 6 125±28 0.115±0.012 0.066±0.015 0.198±0.004中剂量组0 6 115±32 0.119±0.003 0.068±0.011 0.210±0.017低剂量组0 6 156±23*0.118±0.006 0.058±0.013 0.200±0.000对照组90 6 113±26 0.079±0.031 0.067±0.027 0.194±0.013高剂量组90 6 124±20 0.077±0.007 0.052±0.014 0.188±0.021中剂量组90 6 107±18 0.075±0.008 0.052±0.010 0.197±0.006低剂量组90 6 115±33 0.078±0.004 0.066±0.007 0.193±0.016对照组180 6 150±19 0.067±0.010 0.059±0.006 0.179±0.025高剂量组180 6 143±24 0.056±0.005*0.055±0.011 0.179±0.025中剂量组180 6 125±19* 0.054±0.004*0.059±0.011 0.197±0.020低剂量组180 6 136±19 0.063±0.007 0.047±0.005*0.176±0.017对照组224 2 148 0.085 0.045 0.188高剂量组224 2 86 0.041 0.041 0.200中剂量组224 2 129 0.05 0.050 0.223低剂量组224 2 109 0.052 0.052 0.190

3.2 血液学指标

药前健康体检时,给药组个别血液学指标与对照组比较有统计学差异,但绝对值差别较小,判定为正常生理范围内的波动.给药结束时精苓消瘤胶囊1.50 g/kg组的WBC与对照组比较绝对值有所升高(26.3±10.5*↑,vs 16.2±4.5,109/L,*P＜0.05),恢复期结束时未见异常,见表2.

表2 精苓消瘤胶囊对Beag le犬血液学指标的影响

注:与对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01

组别 天数/d动物数/只WBC/(109◦L-1)RBC/(1012◦L-1)HGB/(g◦L-1)HCT/%MCV/fL MCH/pg RDW-CV/%PLT/(109◦L-1)MPV/fL对照组-7 6 20.9±5.1 7.32±0.69 166.2±18.4 43.2±5.1 58.9±1.9 22.7±0.8 14.8±0.6 318.7±110.8 5.7±0.5高剂量组-7 6 18.8±6.2 7.35±1.11 165.7±24.4 43.4±6.2 59.2±2.8 22.6±1.4 14.6±0.3 255.8±92.1 6.9±0.4*中剂量组-7 6 24.1±4.2 7.36±0.71 160.2±14.6 42.2±3.9 57.4±2.5 21.8±0.9 15.2±0.8 296.5±54.3 6.0±1.2低剂量组0 6 21.7±8.9 7.11±1.09 170.0±27.8 43.2±6.4 60.8±2.6 23.9±1.1 14.3±0.7 331.8±98.5 6.6±1.1对照组0 6 17.1±2.0 5.99±0.55 131.0±10.2 34.6±2.8 57.8±1.8 21.9±1.1 14.9±0.6 242.8±53.2 6.2±0.8高剂量组0 6 16.7±6.8 5.94±1.14 137.8±32.2 36.0±7.8 60.5±3.0 23.1±1.4 14.9±0.7 244.3±84.9 6.2±0.9中剂量组0 6 16.3±4.8 6.17±0.16 138.2±5.0 36.7±1.3 59.5±2.1 22.4±1.0 15.2±0.2 248.2±46.7 6.0±1.2低剂量组0 6 15.6±5.3 6.03±0.58 141.5±19.9 37.0±4.8 61.2±2.9*23.4±1.3 14.9±0.5 289.7±60.6 6.2±0.9对照组90 6 12.8±3.0 7.0±0.9 149.2±16.2 43.5±4.8 62.4±2.3 21.5±1.6 12.7±0.6 255.2±47.4 5.8±0.5高剂量组90 6 14.9±3.7 6.7±0.9 142.3±22.7 41.8±6.1 62.7±2.8 21.3±1.0 12.7±0.9 255.8±66.3 5.8±0.6中剂量组90 6 16.9±5.7 6.7±1.1 145.5±23.8 43.2±6.8 64.1±1.5 21.6±0.5 12.5±0.2 289.0±44.9 5.7±0.9低剂量组90 6 16.6±4.8 7.4±1.3 160.0±34.3 47.1±9.6 63.8±2.3 21.7±0.9 12.5±0.6 329.3±74.8 6.0±0.5对照组180 6 16.2±4.5 8.02±0.70 178.2±14.1 51.8±4.1 64.7±2.0 22.3±0.7 12.5±0.5 327.3±79.8 6.7±0.9高剂量组180 6 26.3±10.5*8.78±1.25 201.5±28.6 56.4±8.0 64.4±3.4 23.1±1.6 12.9±1.2 340.8±119.7 7.2±0.7中剂量组180 6 20.1±4.8 8.41±1.01 191.3±22.7 55.5±6.9 65.9±2.0 22.8±1.0 12.2±0.3 359.2±115.3 7.1±1.0低剂量组180 6 20.1±5.9 8.85±1.38 202.5±26.6 57.6±8.1 65.3±2.2 23.0±0.9 12.6±0.6 386.3±139.3 7.3±1.0对照组224 2 13.2 7.49 165 50.0 67.1 22.1 12 246 6.3高剂量组224 2 17.6 7.02 149 45.6 65 21.2 12 276 6.2中剂量组224 2 22.5 7.57 168 50.1 66.3 22.3 12.2 381 4.6低剂量组224 2 18.1 7.19 162 49.5 68.7 22.5 12.2 281 5.3

3.3 血液生化学指标

给药前生化学检查,个别给药组指标与对照组比较有统计学差异,但绝对值差别较小,为正常生理范围内的波动.给药90 d时,精苓消瘤胶囊1.50、0.25g/kg组的TP与对照组比较有统计学差异(62.0±3.6**↓、61.4±3.2**↓,vs 67.8±1.9 g/L,**P＜0.01),0.60 g.kg-1组的BUN与对照组比较有统计学差异(2.46±0.52*↑,vs 1.65±0.38 mmol/L,*P＜0.05),0.60、0.25 g/kg组的TG与对照组比较有统计学差异(0.40±0.07*↓、0.38±0.08*↓,vs 0.49±0.06 mmol/L,*P＜0.05),其中由于BUN的变化没有剂量反应关系,而且绝对值差别较小,判定无毒理学意义.给药结束时,精苓消瘤胶囊1.50 g/kg组的ALB与对照组比较有统计学差异(31.6±2.7*↓,vs 35.6±2.1 g/L,*P＜0.05),同时GLO绝对值有所增加(37.2±4.6↑,vs 34.9±5.3 g/L,P＞0.05),但各给药组TP于对照组结果较一致.恢复期结束时上述指标统计学差异均消失.见表3.

表3 精苓消瘤胶囊对Beag le犬血液生化学指标的影响

表3 精苓消瘤胶囊对Beag le犬血液生化学指标的影响

注:与对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01

组别 天数/d动物数/只ALT/(U◦L-1)AST/(U◦L-1)TP/(g◦L-1)ALB/(g◦L-1)GLU/(mmol◦L-1)BUN/(mmol◦L-1)TG/(mmol◦L-1)GLO/(g◦L-1)CHO/(mmol◦L-1)对照组-7 6 27.5±4.3 49.0±8.7 61.3±6.2 29.6±3.9 2.51±0.43 2.27±0.66 0.89±0.29 31.7±3.2 3.94±0.37高剂量组-7 6 32.3±5.7 50.0±2.3 59.7±3.4 29.6±3.0 2.97±0.53 2.68±0.79 0.94±0.38 30.2±2.1 3.99±0.86中剂量组-7 6 32.2±7.0 51.2±5.2 59.5±3.3 28.6±2.0 2.51±0.83 2.35±1.20 0.85±0.23 30.8±4.1 3.72±0.74低剂量组-7 6 27.8±9.5 49.5±4.7 60.7±3.8 30.3±1.8 2.89±0.50 3.29±0.97 0.93±0.30 30.4±3.2 4.45±1.11对照组0 6 25.7±5.8 53.8±7.4 62.5±4.2 31.2±2.3 3.25±0.83 3.33±0.65 0.74±0.10 31.3±3.8 4.35±0.92高剂量组0 6 31.2±9.1 55.0±7.5 63.3±5.8 32.7±3.7 3.35±0.40 4.84±1.69 0.77±0.17 30.7±2.7 4.43±0.58中剂量组0 6 31.2±4.5 59.3±7.3 64.8±3.9 34.0±2.2 3.00±0.37 3.58±0.65 0.67±0.16 30.8±2.0 3.87±0.74低剂量组0 6 30.8±7.8 55.0±4.2 64.0±4.1 33.4±2.8 3.01±0.32 4.29±2.00 0.76±0.15 30.6±2.2 4.89±0.72对照组90 6 32.3±5.2 35.2±5.7 67.8±1.9 34.1±1.2 3.78±0.45 1.65±0.38 0.49±0.06 33.7±2.4 3.37±0.74高剂量组90 6 29.8±3.2 34.3±5.3 62.0±3.6**27.4±9.6 3.78±0.38 2.18±0.94 0.55±0.13 34.7±9.7 3.59±0.64中剂量组90 6 27.5±4.6 35.2±3.9 64.0±4.7 33.4±1.4 4.20±0.45 2.46±0.52* 0.40±0.07*30.6±3.8 3.15±0.63低剂量组90 6 27.2±5.0 34.3±5.8 61.4±3.2**31.7±2.4 4.27±0.56 2.31±0.80 0.38±0.08* 29.7±2.2*3.64±0.76对照组180 6 34.2±3.5 32.0±4.7 70.4±5.7 35.6±2.1 5.71±0.93 2.51±0.63 0.49±0.16 34.9±5.3 3.68±1.10高剂量组180 6 30.0±4.4 27.7±4.8 68.8±4.2 31.6±2.7*6.59±0.54 2.72±0.85 0.52±0.15 37.2±4.6 4.36±0.88中剂量组180 6 35.5±10.6 32.5±9.4 67.2±5.8 35.1±4.5 6.54±0.79 3.37±1.73 0.49±0.17 32.1±6.7 3.39±0.90低剂量组180 6 28.8±8.6 31.2±3.8 68.0±4.2 33.6±4.5 6.15±0.59 3.94±1.58 0.49±0.31 34.4±2.5 4.60±1.42对照组224 2 26 44.5 67.4 32.1 3.72 2.79 0.64 35.3 4.19高剂量组224 2 29.5 35.5 64.5 30.5 4.74 3.46 0.51 34 4.22中剂量组224 2 25 45.5 64 31.1 4.38 2.84 0.55 32.9 2.95低剂量组224 2 25.5 42 62.3 29.9 4.42 2.85 0.76 32.5 3.69

3.4 眼科检查

精苓消瘤胶囊各剂量组犬的眼睑、眼底、瞳孔、角膜、结膜、虹膜、晶体均未发现异常变化.

3.5 尿常规检查

给药结束及恢复期结束时进行尿常规分析检查发现,包括对照组在内的各组BLO、KET、PRO有一定的阳性结果,历史数据比较未见明显差别,判定与用药无关.见表4.

表4 精苓消瘤胶囊对Beagle犬尿液生化学指标的影响

3.6 病理学检查

系统尸检,给药结束及恢复期结束各组织及器官均未见异常;脏器重量及脏器系数检查,给药结束时精苓消瘤胶囊各给药组的前列腺重量和脏器系数有所增加,恢复期结束时未见异常,给药结束时各给药组的前列腺组织病理学检查未见异常,故此改变没有毒理学意义,各给药组其他脏器脏器重量和脏器系数与对照组比较均未见明显异常;组织病理学检查,给药结束及恢复期结束,与对照组相比,各给药组均未出现相关毒性病理改变.

4 讨 论

精苓消瘤胶囊对Beagle犬连续给药180 d,各给药组犬的外观、黏膜、活动、体重、体温、食量及病理学检查均未出现异常改变;心电图检查中出现的给药结束后PR与QRS间期异常情况,均在恢复期结束后消失,由于不具备剂量反应关系,故其改变不具备毒理学意义;根据血液学及血液生化学检查出现的异常情况,推断精苓消瘤胶囊1.50 g/kg长期给药可能会导致Beagle犬WBC的升高,TP的轻微降低,ALB的轻微降低和GLO的轻微增高,但TP、ALB、GLO的变化均为一过性,且是否与药物的药理作用有关,值得进一步研究或者参考其他药效药理资料进行验证.

实验结果表明,在本试验条件下,Beagle犬口服精苓消瘤胶囊180 d给药的未见明显毒性反应剂量为0.60 g/kg.

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