菘蓝的染色体制片技术及核型研究

鹿 萍

（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 024000）

菘蓝的染色体制片技术及核型研究

鹿 萍

（赤峰学院 医学院，内蒙古 赤峰 024000）

目的：建立板蓝根染色体制片技术及核型分析方法，以解决生产中品种混乱、品种鉴定的实际问题.方法：以菘蓝种子萌发后的根尖细胞为材料，用不同预处理方法制备染色体标本，选择一种较易制备理想的染色体标本的方法，并利用这些染色体标本对二倍体与四倍体染色体进行了核型分析.结果：确定了菘蓝染色体的制片方法，获得了二倍体、四倍体染色体图片，通过分析二倍体染色体数为14条，核型为公式为2n=2x=14=14m，四倍体染色体数为28条，核型公式为4n=4x=28=28m.

菘蓝；染色体制片技术；核型研究

十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica)的根称为板蓝根（Radix Isatidis），板蓝根药理作用具有抗菌抗病毒，抗钩端螺旋体及解毒作用.临床应用可治流行性感冒，预防流行性腮腺炎，治肝硬化，治肝炎等作用.目前，在生产中，板蓝根品种较为混乱，加上药材生产基地间的频繁引种，使药材生产者对板蓝根的品种难以确定，直接影响了板蓝根药材质量的稳定，以及生产规范化的进行.因此，建立简便的品种鉴定方法具有重要意义.同时，在对菘蓝进行细胞遗传学研究和育种过程中，也常常需要进行染色体检查.染色体计数可以揭示物种的基本种性.对于双亲染色体不等的种间杂种，染色体计数还可以被直接用来判断杂种的真实性.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为二倍体种安国菘蓝和四倍体种安国菘蓝的种子.

1.2 试验方法

1.2.1 催芽 在培养皿内铺上两层滤纸，在湿润的条件下将种子培养萌根，在30℃左右的温度下，待萌发后根长0.5—1.5cm时，保留根尖切下约0.5cm左右的一段作为材料.

1.2.2 预处理 （Ⅰ）将材料置于暗处的敞口培养皿中，用冰水混合物刚浸没材料，处理12h以上；（Ⅱ）在18℃的恒温振荡器（THZ-C）中，用现配的0.002mol.L-1的8-羟基喹啉刚浸没敞口培养皿里的材料，黑暗下振荡，30次/min，处理1-4h.在早晨8：00~9：00之间切取根尖和卷须，设计四种预处理.a、对照，不预处理.b、（Ⅰ）；c、（Ⅱ）；d、（Ⅰ）+（Ⅱ）.

1.2.3 固定 将经过预处理的材料用蒸馏水洗去残液，用现配的Carnoy’sⅠ固定液（无水酒精的体积：冰醋酸体积=3：1）和改良Carnoy’sⅡ固定液（无水酒精：氯仿：冰醋酸=5：2：3）于低温暗处固定材料12h以上，然后转入70%酒精中，冰箱中保存备用.

1.2.4 解离 用1mol/LHCl在电热恒温水箱（HH8型）中于严格的60℃下解离.比较5-6min和10-15min两种时间的解离效果.材料经解离后，用蒸馏水洗涤数次，将材料中的酸洗净，以便染色.

1.2.5 染色压片 先用Schiff’s试剂（脱色的碱性品红）于室温下暗处染色1h再用1%醋酸洋红复染，微烤，敲片、压片.

1.2.6 镜检与摄影 OLYMPUS显微成像系统镜检（BH-2）%照相.先用低倍镜寻找30个分裂相良好的细胞，确定处于不同分裂时期的细胞百分率，然后用高倍镜仔细观察各时期染色体的行为和特征.

2 结果与分析

2.1 不同处理对实验的影响

根据处理效果，发现以低温和化学药剂结合的处理对于根尖是效果最佳，中期分生细胞的比例高达10~15%，仅低温处理与不处理的几乎没有区别，分裂指数都界于1%~5%，两种固定液对根尖的作用等效.对于解离过程超过10min，则容易出现染色体松软膨化现象（表1）.

2.2 二倍体菘蓝与四倍体菘蓝核型分析

二倍体核型模式图见图1：2，核型图见图2：1，核型分析结果见表2.

表1 对菘蓝根尖进行的不同处理及其效果的比较

表2 核型分析结果

根据上述图、表分析，菘蓝二倍体染色体的组型公式为：2n=2x=14=14m，全组染色体总长度为12.61μm，染色体长度变异范围为1.25-2.15μm，全为小染色体.属4A类核型.

四倍体核型模式图见图1，核型图见图2，核型分析结果见表2.

由上述图、表可知菘蓝二倍体染色体组型公式为：4n=4x=28=28m,全组染色体总长度为23.96μm，染色体长度变异范围为1.16-2.62μm，全为小染色体.属4A类核型.

图1 核型模式图

3 讨论

（1）菘蓝染色体很小，因此，在测量长臂和短臂时，难以确定长、短臂的分解线，只有制作染色体分散、染色体分开，而着丝粒未分开的染色体标本，并把染色体相片尽量放大，才能较准确的确定着丝点的位置，使数据可靠.

（2）本实验最终确立的卷须制片流程为：取新萌发的根尖1-3cm，在通气性良好的器皿中用冰水混合物暗处处理12h以上，然后于18℃下用8-羟基喹啉遮光处理2-4h，用Carony’s II固定液固定24h（随后可以转到70%酒精中冰箱中保存备用），经1mol.L-1HCl于严格60℃下解离10-20min后，切取根尖1.5-3mm的分生区，用Schiff试剂于阴凉处遮光染色1h，再用1%醋酸洋红滴染、微烤、敲片、压片、镜检和照相.

（3）最后确立了四倍体菘蓝为28条染色体，为二倍体加倍.

图2 核型图

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R285.5

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1673-260X（2010）01-0022-03