新疆锁阳线粒体nad 1基因第2内含子序列居群间变异分析△

王果平，王川易，贾新岳，郭宝林*

（1.新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；2.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100193）

中药资源

新疆锁阳线粒体nad 1基因第2内含子序列居群间变异分析△

王果平1，王川易2，贾新岳1，郭宝林2*

（1.新疆中药民族药研究所，新疆 乌鲁木齐 830002；2.中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所，北京 100193）

目的：对分布于新疆的锁阳Cynomorium songaricum4个居群22个个体进行了线粒体nad1基因第2内含子序列的比较研究，分析序列居群差异。方法：提取锁阳DNA，用通用引物扩增线粒体nad1基因第2内含子序列，ClustalW软件比较分析序列。结果：锁阳22个样本的nad1基因第2内含子序列变异均表现为插入和缺失，无碱基替换发生，有13个个体序列完全一致，9个个体有变异位点，变异位点为10个；4个居群间分化不明显，其中b居群可能存在一定的分化，有两个个体y 4和a 19存在较大的变异，可能具有一定的遗传学意义。结论：线粒体nad1基因第2内含子序列给出的锁阳4个居群分化不明显。

锁阳；nad1基因第2内含子；序列分析

相对于植物的核基因和叶绿体基因，利用线粒体基因组的DNA片段进行分子标记研究的较少，一方面是因为植物线粒体基因组的进化速率比叶绿体基因组更慢，从而提供的信息有限，另一方面由于植物基因组在大小和结构上十分不稳定（高频率重排、重复或缺失以及外源DNA的转入等）。但最新的研究表明，植物线粒体基因组中有些片段，如与呼吸代谢有关的基因相对稳定，且其中存在进化较快的内含子，因此某些线粒体DNA片段信息同样可以提供重要的分子标记信息［1］。nad1基因编码线粒体呼吸链的复合体Ⅰ-泛醌氧化还原酶（NADH，即NADH脱氢酶）的nad1亚基，是一个结构比较稳定的线粒体基因，由5个外显子组成，其中的第2内含子被较多研究和关注，如Sperisen C［2］分析了挪威云杉种群间的差异，Gugerli F［3］则讨论了松属部分种的系统发育关系，Sanjur等［4］利用线粒体nad1基因第2内含子序列分析阐明了南瓜属Cucurbita驯化种与野生种间的亲缘与进化关系。郭亚龙等［5］基于nad1基因第2内含子序列讨论了Porteresia coarctata在稻族中的系统位置。张婷［6］报道了nad1基因第2内含子序列在石斛属鉴定中的应用。谭功燮［7］根据nad1基因第2内含子序列对糯玉米进行系统分类，验证了糯玉米在玉蜀黍属中的系统学价值。已有的报道均表明该序列在种以上的系统学研究中具有价值，本文首次报道nad1基因第2内含子在常用中药锁阳Cynomorium songaricum分布于新疆的4个居群间的变异情况。

1 材料、试剂和仪器

1.1 材料

研究样品于2008年5～6月采自新疆锁阳两个自然分布区，包含3个县4个居群的22个样本，采集信息详见表1。

表1 锁阳样品来源

1.2 主要试剂

天根DNA提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］；2×PCR StarMix（北京康润诚业生物科技有限公司）。

1.3 仪器

美国BIO-RAD凝胶成像系统，Gene Quant 100紫外可见光分光光度计，TG16-W微量高速离心机，MG96＋Long Gene基因扩增仪等。

2 方法

2.1 总DNA提取

按照天根试剂盒方法提取植物基因DNA，1.0%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总DNA的质量和浓度。

2.2 PCR扩增引物

根据南瓜属［2］（NCBI登录号gi18378499）序列设计扩增引物nad1-2intron-up（5′-GGTCTTATTCTT ATTGTGCGCCT-3′）和nad1-2intron-low（5′-TTC GTCTATACCAGACCATAAGG-3′）以及一对测序引物WCY-F（5′-GACCATATCTGCTTTTGCG-3′）和WCY-R（5′-GTCATAGGG TGGGCTTCG-3′）。反应体系（20μL）：2×Taq PCR starmix 10μL，2μm primers 12μL，2μm primers22μL，template DNA 100 ng左右，补足ddH2O至20μL。反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性1min，52℃退火40 s，72℃延伸1 min 50 s，35个循环，72℃保温7min。送北京六合华大基因公司测序。

2.3 序列分析

序列比对以ClustalW软件进行分析。

3 结果与讨论

3.1 PCR扩增

扩增产物为长度约1 000 bp的单一条带，部分样品PCR产物扩增见图1。

图1 nad 1第2内含子PCR扩增产物

3.2 序列变异特点

本研究测得的锁阳线粒体nad 1基因第2内含子序列长度范围为924～999 bp，22个个体样品中有13个样品序列一致，长925 bp，但各居群均有变异样本：y居群有1个变异样本，a和t居群各有2个变异样本，b居群有4个变异样本，见表2。所有变异位点以插入为主，有单碱基插入，如t 1和t 9仅在一个位置上有单碱基插入，y 4则在6个不同的位置上有单碱基插入；也有多碱基插入，如b 21、b 25、b 26、b 215均在685～694 bp位点有10碱基的插入，而a 19则有长达74个碱基的插入，成为最长的一个序列，长达999 bp，仅有一个样本a 16出现单碱基缺失，成为最短的序列，长924 bp。

如果把每一次插入或缺失作为一个变异位点，变异位点数10个。

表2 新疆锁阳样品序列变异表

3.3 居群间和居群内变异分析

全部变异位点中仅t9和y 4在102 bp位置上有单碱基插入，b居群4个个体在685～694 bp位置有10碱基插入，共2个信息位点，其他均为单一变异位点，难以进行样本间的系统学分析。

每个居群几乎都有超过50%的样本（b居群稍少）序列表现为完全一致，表明锁阳表现在nad 1基因第2内含子上的居群间分化不明显，但其中的b居群中研究的7个个体中有4个个体都存在同一位点的10碱基插入，表明b居群可能存在一定的遗传分化。

而在各居群内，以个别样本出现特有的单碱基插入或缺失为主，表明了植物线粒体序列变异以碱基的插入和缺失为主要特点，且以随机的单碱基插入和缺失较为易于发生，从而弱化了这些变异的系统学意义，同样的情况在谭功燮［7］等研究糯玉米在玉蜀黍属以及家种玉米品种中的系统学位置中也出现过，难以据此建立比较好的分子系统树。

不过样本y 4在6个位置上都出现单碱基插入，样本a 19出现了1个74 bp的长片段插入，可能是有意义的，有待于结合其他分子标记和形态学特征等的研究加以证实。

［1］Demesure B，Sodzi N，Petit R J，et al.A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrialand chloro-plastDNA in plants［J］.Molecular Ecology，1995，4：129-131.

［2］Sperisen C，Bfichler U，Gugerli F，et al.Tandem repeats inplant mitochondrial genomes：application to analysis of population differentiation in the conifer Norway spruce［J］.Mol Ecol，2001，10：257-263.

［3］Gugerli F，Senn J，AnzideiM，et al.Chloroplastmicrosatellites and mitochondrial nad 1 intron 2 sequences indicate congruent phylogenetic relationships among Swiss stone pine（Pinus cembra），Siberian stone pine（Pinus sibirica）and Siberian dwarf pine（Pinus pumila）［J］.Mol Ecol，2001，10：1489-1497.

［4］Sanjur O I，Piperno D R，Andres TC，et al.Phy-logenetic relationships among domesticated and wild species of Cucurbita（Cucurbitaceae）inferred from a mitochondrial gene：Implications for cro Pplant evolution and areas of origin［J］.PNAS，2002，99（1）：535-540.

［5］郭亚龙，葛颂.线粒体nad1基因内含子在稻族系统学研究中的价值——兼论Porteresiad的系统学位置［J］.植物分类学报，2004，42（4）：333-344.

［6］张婷，王峥涛，徐珞珊，等.线粒体nad 1内含子2序列在石斛属植物分子鉴定中的应用［J］.中草药，2005，36（7）：1059-1062.

［7］谭功燮，田孟良，黄玉碧.根据线粒体nad1基因第2内含子的序列多态性对糯玉米进行系统分类［J］.四川农业大学学报，2007，25（1）：31-34.

The Variation Study of Mitochondrial nad 1 Gene Intron 2 among Populations of Cynomorium Songaricum in Xinjiang

Wang Guoping1，Wang Chuanyi2，Jia Xinyue1，Guo Baolin2
（1.XinJiang Institute of Chinese Medicine and Ethical Medicine，Urumqi Xinjiang830002，China；2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing100193，China）

Objective：To examine population variation of mitochondrialnad1 intron 2 within 22 individual samples from 4 populations ofcynomorium songaricumin Xinjiang.Methods：Total DNA was extracted，then the mitochondrial nad1 intron 2 of samples were PCR amplified and sequenced.Sequences alignment were performed using Clustal W software package.Results：The variation of mitochondrialnad1 intron 2 sequences among twenty-two individuals is base insertions or deletions，the sequences of13 individuals are completely the same，the rest9 samples have 10 mutation sites in total.Among the 4 populations only population bmay have differentiation in the sequence，in which the variation of y 4 and a 19 sample is significant.Conclusion：The sequecnce differentiation ofnad1 intron 2 incynomorium songaricumisn′t obvious among 4 populations.

Cynomorium songaricum；nad1 intron 2；Sequence analysis

中国重点药用生物资源调查项目——新疆紫草等四种药用生物资源调查（YSZ-428-0816）；新疆中药民族药研究所基金项目——新疆锁阳遗传多样性研究

*郭宝林，Tel：（010）62895049，E-mail：guobaolin010＠yahoo.com.cn

2010-04-22）