双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

李军华，韩翠芹，邓捷，王华岩

西北农林科技大学动物医学院 陕西省干细胞工程技术研究中心 陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100

生物技术与方法

双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

李军华，韩翠芹，邓捷，王华岩

西北农林科技大学动物医学院 陕西省干细胞工程技术研究中心 陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100

利用DNA同源重组方法 (基因打靶) 对动物基因组进行修饰是转基因研究的重要手段之一。为了构建一个高效的通用型基因打靶载体，本研究以pBS246质粒为骨架，在两个LoxP序列之间插入正筛选标记新霉素磷酸转移酶(neo)基因和绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因；在两个 LoxP序列外侧分别插入两组携带“8碱基”酶切位点的多克隆位点序列(MCS-1和MCS-2) 和负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV-tk) 基因，构建成通用型基因打靶载体pGT-V1，并且在C2C12细胞中验证了载体中各个元件的功能。该载体具有如下特点：1) 在载体中引入绿色荧光标记，可以实时监控载体的转染效率，而转染效率的提高为高效基因打靶提供了保证；2) 在两个 LoxP位点间插入绿色荧光标记，可以直观监测打靶后遗留的筛选标记的去除情况，并且可以通过流式细胞仪或免疫磁珠法，将最终去除了筛选标记的阳性细胞(即丢失绿色荧光的细胞) 分选出来，降低筛选标记在中靶细胞中可能产生的负面影响；3) 采用“8碱基”酶切位点的MCS序列，便于DNA大片段的连接和重组，极大提高了该载体的通用性。总之，该载体优化了基因打靶的技术手段，为有效开展基因打靶和转基因动物研究提供了新平台。

同源重组，绿色荧光标记，打靶载体，Cre-LoxP

Abstract:Homologous recombination is an important technique that is used to modify mammalian genome. Here, we constructed an efficient common gene targeting vector based on the plasmid pBS246. The vector consisted two positive selection markers,neomycin resistance gene (neo) and enhanced green fluorescent protein gene (EGFP) flanked by locus of X-over P1 (LoxP) sites.Two synthesized multiple cloning sequences MCS-1 and MCS-2 that contain several “8 bp cutter” enzyme sites were placed in outside of LoxP sites. Additionally, a negative selection markerHSV-tk(herpes simplex virus thymidine kinase) gene was located adjacent to MCS-1 site. The constructed vector was named pGT-V1, and its functions were characterized in C2C12 cells. The vector had the following unique features: 1)EGFPwas used to monitor instantly the transfection rate that was essential for increasing the efficiency of gene knockout (KO); 2) TheEGFPmarker located between two LoxP sites was able to be removed from KO positive cells to avoid the potential damage of selection markers to the recipient cells. The process could be monitored visually and the positive cells without selecting markers (the loss of green fluorescent cells) could be sorted out by either flow cytometry orimmunomagnetic beads; 3) “8 bp cutter” restriction sites were embedded in MCS sequences, which then enhanced the versatility of this vector. In summary, the constructed plasmid optimized the vector of gene targeting and provided a new technique means for the transgenic animal research.

Keywords:homologous recombination, green fluorescent protein gene, gene targeting vector, Cre-LoxP

基因打靶技术是建立在上世纪 80年代基因同源重组和胚胎干细胞技术基础上的，它将外源基因定点整合到靶细胞基因组的某一特定位点上，或对某一靶位点进行定点突变，以达到对细胞基因组进行定点修饰的目的，最终改变生物的遗传特性[1]。1981年 Martin[2]和 Evans等[3]成功建立了小鼠胚胎干细胞系 (ES细胞)，使得基因打靶技术能够实际应用于转基因动物研究中。1985年，Smithies等[4]首次利用同源重组方法将一段外源质粒插入到人染色体 β-globin位点上，从而最早在哺乳动物细胞中实现了同源重组。1988年，Capecchi等运用“正负筛选”策略，将2个筛选标记基因neo和HSV-tk装到打靶载体上，使中靶细胞的效率比仅使用单一正筛选标记提高了3～10倍[5]。传统的基因打靶将靶基因在细胞或动物体中的活性完全去除，很容易导致细胞的死亡或胚胎早期发育缺陷。因此，Gu等[6]将Cre-LoxP 基因元件引入到打靶载体上，把在特定发育阶段或特定组织细胞中表达Cre酶的转基因小鼠，与在基因组中引入LoxP锚定序列的小鼠交配，使子代鼠中特定组织细胞中的靶基因被去除。这种具有时空调控特性的条件基因去除技术为研究重要功能基因在组织器官发育、生理过程以及疾病发生中的作用提供了有效的研究手段。

基因打靶技术已经成功运用于转基因羊[7]、牛[8]、猪[9]等实验研究上。但是，目前国内外常用的打靶载体都或多或少的存在一些缺陷，例如，有的载体中引入一种抗药基因作为正筛选标记，但并没有设计好中靶细胞筛选完成后将筛选标记去除的步骤，结果导致中靶细胞中永久携带正筛选标记，这可能是造成体细胞克隆效率低下和克隆动物流产率、畸胎率较高的一个原因。还有一些打靶载体在抗药基因两端加入了 LoxP序列，打靶完成后通过Cre-LoxP系统去除中靶细胞中的正筛选标记，但是他们忽略了一个重要问题：如何有效地将去除正筛选标记的中靶细胞筛选出来？因为转染的效率无法达到100%，Cre酶的工作效率也无法达到100%。为克服上述不足，有必要构建一个更为完善的基因打靶载体。本研究在2个LoxP序列之间插入neo作为正筛选标记的同时，再插入EGFP序列，这样基因打靶完成后，通过观察绿色荧光的变化，就可以实时监测中靶细胞的筛选情况。最重要的是，可以通过流式细胞仪或免疫磁珠法将去除筛选标记的中靶细胞筛选出来。因此，本研究对动物转基因研究具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

成肌细胞C2C12、大肠杆菌菌株DH5α、TOP10由本中心保存；pIRES-neo、pEGFP-C1载体购自Clontech公司；pBS246、pBS185载体和转染试剂Lipofectamine TM2000购自 Invitrogen公司；pORF-HSV1tk载体购自InvivoGen公司；限制性内切酶购自MBI公司；T4 DNA连接酶、Klenow大片段、T4 DNA磷酸激酶、DNA marker等购自TaKaRa公司；G418、DMEM干粉 (高糖)、胎牛血清购自 Gibco公司；丙氧鸟苷 (GAC) 购自Sigma公司；DNA片段快速回收试剂盒购自BioDev-tech公司；小量质粒抽提试剂盒购自Vigrous公司。

1.2 载体的构建

1.2.1载体构建的技术路线图

载体构建经过3个大的步骤，具体技术路线见图 1。

1.2.2构建过渡载体pING

将载体pEGFP-C1经NheⅠ单酶切和Klenow补平后再用BglⅡ单酶切，并通过凝胶电泳回收EGFP片段，然后将其插入到经EcoRⅤ和BamHⅠ双酶切的pIRES-neo中，得到pING载体，并分别用BglⅡ和KpnⅠ进行单酶切鉴定。

图1 载体构建流程图Fig.1 Flow diagram of vector construction.

1.2.3构建过渡载体pBS246/tk

分别合成2段含多个“8碱基”酶切位点的DNA小片段，MCS-1 (5′−3′)：AATTCGCCCGGGCCCTCA GCAGCGCTGGCGCGCCGCTAAGCGGGTCCCGC TAGC 和 MCS-2 (5′−3′)：CTAGTTAATTAAGGCCG GCCGACTTAGTCCTGAGGACCGGTGTTTAAACC A。将2个片段分别插入到pBS246载体的EcoRⅠ位点 (MCS-1) 和SpeⅠ/NdeⅠ位点 (MCS-2) 处，得到 pBS246/MCS。然后用EcoRⅠ单酶切pBS246/MCS，经Klenow补平后，再用NotⅠ单酶切，凝胶回收线性化的pBS246/MCS；NotⅠ/SwaⅠ/AseⅠ三酶切 pORF-HSV1tk，凝胶回收含有启动子及 ployA序列的HSV-tk片段，最后将HSV-tk序列克隆到线性化的pBS246/MCS中，构建成pBS246/tk载体。分别用SmaⅠ、PstⅠ单酶切，以及PacⅠ和AscⅠ双酶切进行鉴定。

1.2.4构建通用打靶载体pGT-V1

XhoⅠ单酶切 pING，经 Klenow补平后再用NruⅠ单酶切，电泳回收EGFP/IRES/neo目的片段。将目的片段连接到经BamHⅠ单切及Klenow补平后的pBS246/tk载体上，构建完成pGT-V1载体。分别用KpnⅠ和SpeⅠ单酶切进行鉴定。

1.3 载体相关元件的功能检测

1.3.1细胞培养及药物筛选浓度测定

小鼠成肌细胞 C2C12在含 10%胎牛血清的H-DMEM 培养基中培养，培养条件为 37℃、5%CO2饱和湿度。待细胞生长至 70%～80%满时，将C2C12细胞接种到24孔细胞培养板上，分别加入不同浓度的G418和GAC筛选1周，统计G418和GAC的最低致死浓度。

1.3.2质粒转染及其抗药性检测

用NotⅠ位点将pGT-V1载体线性化，然后通过电穿孔方法将pGT-V1导入C2C12细胞。转染24 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光，并在培养基中加入最低致死浓度的G418进行药物筛选，以未转染质粒的C2C12细胞作为阴性对照组，2～3周内观察细胞抗药的结果。挑选抗G418的细胞克隆，再在培养液中加入筛选浓度的GAC，对中靶细胞进行负筛选。同时，以未转染质粒的C2C12细胞作为阴性对照组，1周内观察结果。

1.3.3Cre-LoxP系统的功能验证

质粒 pBS185带有Cre基因，通过电穿孔法将10 μg pBS185质粒导入带有 G418抗性的 106细胞中。同时，以相同体积的超纯水转染作为阴性对照，24 h后荧光显微镜下观察电转染前后绿色荧光细胞比例的变化。然后通过流式细胞仪分选EGFP阳性和阴性细胞，计算Cre酶对LoxP序列进行剪切、重组的效率。考虑到电转染效率无法达到 100%，所以对已转染过 1次的细胞待重新贴壁后，进行第 2次电转染，以便进一步检测Cre-LoxP元件的功能。另外，为在基因组水平上进一步检测Cre-LoxP系统的功能，在阳性细胞中导入 Cre酶后，提取基因组DNA，并以未转染Cre酶的阳性细胞作为对照，通过半定量 PCR验证转染 Cre酶后细胞基因组上的EGFP含量变化。PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性 30s，58℃退火 30s，72℃延伸 50s，30个循环 (GAPDH：27个循环)；72℃延伸10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离检测，然后通过全自动凝胶成像分析仪Gene genius扫描，目的片段与内参的光密度之比作为目的片段的相对光密度值，通过EXCEL软件对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 载体酶切鉴定及分析

2.1.1pING的鉴定

将目的基因EGFP序列克隆到载体 pIRES-neo中，得到pING阳性质粒 (图2A)。pING经BglⅡ酶切得到1 937 bp和3 839 bp两个片段，经KpnⅠ酶切得到1 565 bp和4 411 bp两个片段。电泳结果与设计相符 (图2a)，证明pING载体构建正确。

2.1.2pBS246/tk的鉴定

将合成的多克隆位点序列MCS-1插入到pBS246的EcoRⅠ位点处，MCS-2插入到SpeⅠ/NdeⅠ位点间，构建完成 pBS246/MCS。最后，将包括启动子及ployA序列的HSV-tk克隆入 pBS246/MCS，构建完成 pBS246/tk (图 2B)。用SmaⅠ和PstⅠ单酶切 pBS246/tk质粒分别得到 4 484 bp、44 bp和2 328 bp、2 200 bp片段；用PacⅠ和AscⅠ双酶切得到4 300 bp和228 bp两个片段 (图2b)，这些结果均与设计相符，证明pBS246/tk载体构建正确。

2.1.3pGT-V1的鉴定

通过平末端连接的方法，将带有EGFP/IRES/neo的基因片段克隆到 pBS246/tk中，构建完成pGT-V1 (图2C)。用KpnⅠ单酶切pGT-V1质粒得到3 764 bp、1 716 bp和1 565 bp三个片段，用SpeⅠ单酶切得到3 496 bp、2 130 bp和1 419 bp三个片段(图2c)，结果均与设计相符。

图2 重组质粒结构示意图及酶切鉴定Fig.2 Schematic of recombinant plasmids and the enzyme mappings. (A) Structure of pING. (a) pING digested by enzymes. 1:BglⅡ digestion; 2:KpnⅠ digestion. (B) Structure of pBS246/tk. (b) pBS246/tk digested by enzymes. 1:SmaⅠ digestion; 2:PstⅠdigestion; 3:PacⅠ/AscⅠ double-digestions. (C) Structure of pGT-V1. (c) pGT-V1 digested by enzymes. 1:Kpn Ⅰ digestion; 2:SpeⅠdigestion. M: molecular weight marker.

2.2 pGT-V1载体的功能验证

2.2.1G418和GAC最低致死浓度测定

经过1周的浓度梯度筛选，C2C12细胞用G418处理的最小致死浓度是 400 μg/mL，因此，采用400 μg/mL G418浓度用于筛选。C2C12细胞用6 μmol/L GAC处理后全部致死，而在用 4 μmol/L GAC时大部分细胞仍能存活，所以GAC的筛选浓度定为 4 μmol/L。

2.2.2荧光标记和正负筛选标记功能的检测

采用电穿孔方法将pGT-V1导入C2C12细胞，对照组细胞不加质粒以同样条件电转染。转染24 h后，在荧光显微镜下观察，实验组有30%左右的细胞发绿色荧光 (图3A)，而对照组没有观察到绿色荧光 (图3B)。随后，在培养液中加入400 μg/mL G418进行药物抗性筛选，每2天换液1次。7～10 d左右，对照组细胞几乎全部死亡，而实验组也有相当数量的细胞死亡，然后将G418的浓度减为200 μg/mL，继续筛选。3周后，培养皿中出现G418抗性细胞克隆。将G418抗性细胞扩增培养，在荧光镜下检测发现，视野内观察的细胞都发绿色荧光 (图3C)，证明成功筛选出稳定转染pGT-V1的细胞株。

在检测负筛选标记基因时，将转染 pGT-V1的阳性细胞培养在 4 μmol/L GAC的培养液中，经过4～5 d的生长，实验组细胞全部死亡 (图3D1)，而未转染pGT-V1的对照组细胞仍然存活(图3D2)。此结果证明HSV-tk整合到细胞染色体基因组上，并能正常表达导致细胞死亡。

2.2.3Cre-LoxP功能的检测

为验证pGT-V1载体上的Cre-LoxP基因元件是否有功能，我们将带有Cre酶的质粒pBS185 (10 μg)通过电穿孔法导入EGFP阳性的细胞中。转染24 h后，荧光镜下观察绿色荧光细胞比例的变化。对比未转染Cre酶的EGFP阳性细胞组 (图4A)，转染了Cre酶的细胞组中有一定比例的细胞丢失了绿色荧光 (图4B)，表明这些中靶细胞内位于LoxP区间的药物筛选标记和EGFP基因已被Cre酶清除。为定量分析Cre酶去除LoxP片段的效率，我们采用流式细胞仪对 Cre酶处理的细胞进行了定量检测。以未转染的C2C12细胞作为阴性对照 (图4C1)，稳定转染的EGFP阳性细胞经流式仪定量检测后发现，有83.4%的细胞为EGFP阳性，16.6%的细胞为EGFP阴性 (图4C2)。而经过Cre酶处理后的EGFP阳性细胞组，有 61.2%的细胞为EGFP阳性，38.8%的细胞为EGFP阴性。与未经Cre酶处理的组比较，丢失绿色荧光的细胞数增加了22.2% (图4C3)。由于电转染效率达不到100%，从而影响了Cre酶去除LoxP片段的效率。因此，我们对第1次转染的细胞又进行了1次电转染，经第2次Cre酶处理后，丢失绿色荧光的细胞比率提高到59.9% (图4C4)。以上结果表明，经过 Cre酶处理后，约 1/2的EGFP阳性细胞去掉了LoxP片段。在基因组水平上通过半定量PCR实验证明，与对照组相比，Cre酶处理的EGFP阳性细胞组内，EGFP基因的含量明显减少(图4D)。以上结果表明，通过对EGFP的监控，证明了Cre酶能有效地将LoxP位点间的打靶筛选标记基因从靶细胞的基因组中去除。

3 讨论

对染色体DNA进行修饰有多种手段，如病毒载体转染[10]、转座子方法[11]、锌指核酸酶方法[12]等，但目前普遍采用的主要还是基因打靶方法。基因打靶的策略主要有正负筛选标记法、启动子或 PolyA捕获法、标记靶基因融合法、锌指核酸酶法等[13-14]。上述方法各有其特点，但也存在一些问题，例如，对某基因座进行定点敲除，必须要在打靶载体上连入相应的同源臂，而同源臂自身往往带有多个酶切位点，这就为同源臂克隆入打靶载体带来了极大的困难。许多商品化和自建的打靶载体，要么缺少多克隆位点，要么载体上的多克隆位点都是常见的酶切位点，往往会与同源臂自身所带的酶切位点相同，这就给长、短臂DNA片段的连接重组带来了困难。其次，一方面许多打靶载体缺少必要的筛选标记，给打靶后的阳性细胞筛选带来困难。另一方面一些带有正/负筛选标记的打靶载体，不能有效去除打靶后在中靶细胞内遗留的筛选标记，因为携带某些筛选标记有可能会影响中靶细胞的正常生理功能，或影响体细胞胚胎克隆效率。最重要的是，在大动物细胞的基因打靶研究上，许多携带Cre-LoxP系统的打靶载体，由于缺乏有效的筛选手段，无法筛选出去除筛选标记的阳性细胞克隆，从而未能发挥Cre-LoxP系统应有的功能，为转基因研究带来极大不便。鉴于以上问题，我们在总结前人经验的基础上，设计构建了一个带有neo/HSV-tk正负筛选标记和绿色荧光筛选标记的双筛选标记打靶载体。该载体转染受体细胞后，一方面通过neo和HSV-tk的正负筛选可以有效地富集阳性细胞克隆，另一方面，通过将绿色荧光标记与Cre-LoxP系统相结合，构成一个基因打靶筛选标记去除监测系统，这个系统既可以监测打靶后期neo等筛选标记的去除情况，又可以利用绿色荧光标记有效地将去除筛选标记的阳性细胞筛选出来，完善了基因打靶技术。

图3 荧光及正负筛选标记基因的检测Fig.3 Fluorescence detection and anti-drugs selection. (A)C2C12 cells transfected with pGT-V1 (24 h). 1: fluorescence; 2:phase contract. (B) C2C12 cells without transfection. (C) The positive clones selected by G418. 1: fluorescence; 2: phase contract. (D) G418 resistant cells selected by GAC (5 days). 1:cells selected by GAC; 2: C2C12 cells without transfection.

图4 Cre-LoxP系统功能验证Fig.4 Cre-LoxP function analysis. (A) The pGT-V1 stable-transfected cells. 1: fluorescence; 2: phase contract. (B)The pGT-V1 stable-transfected cells were transfected with plasmid pBS185 that contains Cre gene. 1: fluorescence; 2:phase contract. (C) The flow cytometry analysis of Cre treated cells. 1: C2C12 cells as the negative control; 2: pGT-V1 stable-transfected cells; 3: Cre treatment for once; 4: Cre treatment for twice. (D) Semi-quantitative PCR determination ofEGFPgene content. 1: pGT-V1 stable-transfected cells without Cre treatment; 2: pGT-V1 stable-transfected cells with Cre treatment.

在实验过程中我们发现，在阳性克隆筛选完成后，通过荧光显微镜观察，视野内的细胞全部发出绿色荧光 (图3C)，但是通过流式细胞仪进行定量检测却发现，只有83.4%的细胞为EGFP阳性(图4C2)。这提示我们，通常通过抗药性筛选得到的阳性克隆很可能是不纯的，有部分细胞克隆是假阳性的。我们构建的载体pGT-V1就很好地克服了这种弊端，阳性克隆筛选完成后，可以利用绿色荧光通过流式细胞仪进行初步分选，避免了假阳性造成的干扰。另外，在对Cre-LoxP系统的功能进行验证的实验中，我们发现经过Cre酶处理后的EGFP阳性细胞组，有 61.2%的细胞为EGFP阳性，38.8%的细胞为EGFP阴性。与未经Cre酶处理的组相比，丢失绿色荧光的细胞数增加了22.2% (图4C3)。这提示我们：如果没有EGFP的荧光标记进行实时监测，很难保证Cre酶去除LoxP片段的效率，从而导致最终得到的标记基因去除的阳性细胞少之又少。由于电转染效率达不到100%，因此会影响Cre酶去除LoxP片段的效率。于是，我们对第 1次转染的细胞又进行了1次电转染，经第2次Cre酶处理后，丢失绿色荧光的细胞比率提高到59.9% (图4C4)，证明了我们构建的基因打靶载体能够精确监测Cre-LoxP系统的工作效率。但是，由于质粒稳定转染会出现多拷贝随机整合的情况，筛选完成后在中靶细胞基因组上能出现多个LoxP位点，通过Cre介导的剪切重组会出现多种情况。这与在载体中连入同源臂后进行基因打靶后只会整合单拷贝的载体还是有所不同的。

在该载体中引入了“8碱基”酶切位点组成的2个多克隆位点元件：MCS-1和MCS-2。理论上计算“8碱基”酶切位点在DNA序列中出现的机率是“6碱基”酶切位点的1/16，平均在5～6 kb长度上才有可能出现一个“8碱基”酶位点，因此解决了在打靶片段与载体连接时出现的酶切位点冲突的困扰，极大地方便了打靶同源臂的连接。目前国内外将打靶载体导入受体细胞所采用的方法主要是脂质体转染和电穿孔法，这2种方法都存在一个转染效率的问题，要想提高基因打靶的效率，首先要提高载体转染的效率。利用载体中引入的绿色荧光标记可以直观地估计每次转染的效率，不断地摸索转染条件，提高转染效率，从而保证了基因打靶的效率。最后，在基因打靶完成后的筛选过程中，通过观察绿色荧光我们可以实时监测中靶细胞的筛选情况，对阳性克隆的筛选进度有了直观的了解，有效地避免了常规筛选存在的盲目性和不可预知性。另外，本研究是以小鼠的成肌细胞C2C12作为细胞模型对抗药性元件进行验证的，由于不同物种和类型的细胞对药物的敏感性是不同的，所以在对大动物进行体细胞的基因打靶研究时，G418和GAC的的筛选浓度还需要重新进行测定。

总之，本研究在总结传统打靶载体的基础上，设计了双筛选标记，使基因打靶技术更加完善，并且具有广泛应用价值，为动物遗传育种和转基因动物克隆研究提供新的技术手段。

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Construction and functional analysis of a common gene targeting vector with double-selection markers

Junhua Li, Cuiqin Han, Jie Deng, and Huayan Wang

Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture,Shaanxi Center for Stem Cell Engineering and Technology,College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling712100,China

Received:March 22, 2010;Accepted:May 14, 2010

Supported by:Grants of New Transgenic Technology and Method (No. 2008X08010-001), National Major Special Project on New Varieties Cultivation for Transgenic Organisms (No. 2009ZX08007-008B).

Corresponding author:Huayan Wang. Tel: +86-29-87080069; E-mail: hhwang101@163.com

转基因新技术新方法研究 (No. 2008X08010-001)，转基因生物新品种培育重大专项 (No. 2009ZX08007-008B) 资助。