高山被孢霉产花生四烯酸及其遗传改造的研究进展

丛蕾蕾，彭超，纪晓俊，黎志勇，尤江英，路金淼，黄和

南京工业大学生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 210009

代谢工程

高山被孢霉产花生四烯酸及其遗传改造的研究进展

丛蕾蕾，彭超，纪晓俊，黎志勇，尤江英，路金淼，黄和

南京工业大学生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 210009

花生四烯酸作为一种重要的多价不饱和脂肪酸，因其具有多种生理功能而被认为是潜在的食品添加剂和药物。近年来，利用高山被孢霉合成花生四烯酸已成为研究热点。前期相关研究主要集中在菌种选育及发酵调控方面。随着研究的不断深入，关于高山被孢霉合成花生四烯酸的代谢途径的研究取得了较大进展。以下简要概述前期工作进展，着重论述花生四烯酸合成途径的关键酶及其高山被孢霉的遗传改造的研究情况，包括生物合成花生四烯酸代谢途径、关键酶及其应用、高山被孢霉的遗传操作系统的构建以及遗传改造的应用，并对其研究前景进行了展望。

花生四烯酸，高山被孢霉，关键酶，遗传操作系统，遗传改造

Abstract:Arachidonic acid, as an important polyunsaturated fatty acid, is identified as potential food additives or pharmaceuticals for their biological activities. In recent years, arachidonic acid production byMortierella alpinais becoming a research highlight.The prophase relevant researches focused on the mutagenic breeding and fermentation optimization. With the depth of investigation,the advancement concerning pathway for the biosynthesis of arachidonic acid inMortierella alpinahas been made. In this review, we summarized the prophase work briefly. Mainly, we discussed the biosynthesis pathway of arachidonic acid, the key enzymes, the construction of transformation system and the genetic modification. In addition, the prospect of microorganism arachidonic acid production is put forward.

Keywords:arachidonic acid,Mortierella alpina, key enzymes, transformation system, genetic modification

多价不饱和脂肪酸 (Polyunsaturated fatty acids，PUFAs) 是指一系列含有2个或2个以上非共轭顺式双键的 C16-22的多不饱和脂肪酸[1]。花生四烯酸(Arachidonic acid，简称AA或ARA)，属于 ω-6系列多不饱和脂肪酸，结构式如图1所示。ARA不仅是机体组织细胞膜的结构成分；同时也是前列腺素、环前列腺素和白三烯类等二十碳衍生物的直接前体[2]。其具有多种生理活性[3]，已在保健食品、医药、化妆品等领域得到广泛应用。

图1 ARA结构式Fig.1 The structural formula of ARA.

高山被孢霉Mortierella alpina被认为是最佳的ARA生产菌株，它具有ARA含量高且PUFAs组成合理等特点，研究较多。目前，利用M. alpina发酵生产ARA的研究主要集中在菌种选育、培养基优化和关键酶等方面。近年来，本实验室在利用M. alpina发酵生产ARA方面展开了研究，研究工作主要集中在高产菌株的诱变选育[4]、培养基优化[5]和发酵工艺优化[6]等方面。在研究过程中发现，油脂中ARA占总脂肪酸的百分含量较低，这也是利用微生物发酵生产ARA油脂的技术瓶颈。利用传统的生物工程技术，如诱变选育以及发酵过程控制等，都无法对ARA合成代谢途径进行有针对性的、定向的调控从而突破该瓶颈。利用基因工程技术对 ARA产生菌M.alpina进行遗传改造，可以定向选育ARA高产菌株，进一步大幅度提高ARA发酵生产水平。本文简要概述了利用微生物发酵法生产ARA的研究进展，着重论述了生物合成 ARA代谢途径中的关键酶以及利用基因工程技术对 ARA生产菌株进行遗传改造的研究，对未来发展趋势进行展望，并提出了这一研究领域未来可能的研究方向。

1 ARA产生菌诱变选育

微生物发酵生产 ARA过程中，获得一株性状优良的生产菌株是 ARA发酵生产的关键。因此，对生产菌种进行诱变选育是提高 ARA发酵水平的首要工作。1987年，Totani和Oba[7]发现M. alpina的某些菌株中，ARA累积量能达到总脂肪酸含量的68.5%～78.8%。1996年，Eroshin等[8]发现被孢霉菌对培养基中的乙酰水杨酸敏感，利用含乙酰水杨酸的培养基选择性地筛选了产 ARA的被孢霉，ARA含量超过 40%。1997年，Chen等[9]在 10℃的低温下筛选到一株油脂中ARA含量达42.4%的菌株M.alpinaWuji-H4。2002年，Yuan等[10]利用离子束注入生物技术对M. alpina进行诱变，筛选到高产菌株I49-N18，并进行了 50 t罐发酵试验，ARA产量为5.11 g/L。2004年，Sakuradani等[11]用亚硝基胍(MNNG) 诱变M. alpina1S-4得到了ω-3脱氢酶活性较低的突变株Yl1，其ARA产量从3.74 g/L提高到了4.97 g/L。本实验室ARA生产菌株M. alpinaME-1[12-13]是利用代谢控制育种原理，自行诱变筛选获得的。该菌株现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCM207067。对已有文献报道中ARA含量较高的菌株进行了总结比较，由表1可知，本实验室所保藏的菌株M. alpinaME-1的ARA发酵水平已处于世界领先水平。

表1 不同菌株发酵产ARA水平Table 1 The fermentation level of ARA production by various microorganisms

2 ARA发酵调控

ARA产量主要受菌体生物量、总油脂含量和油脂中ARA的含量等因素的制约，而它们主要都受外界环境如培养基的组成和发酵工艺等因素的影响。为了在实际生产中获得高纯度和高浓度的 ARA油脂，必须对培养基和发酵工艺进行研究，以期获得高生物量、油脂含量和ARA含量。

在发酵过程中，培养基的组成不仅影响生产效率，也影响菌丝的形态，而菌丝形态则影响到气体的扩散、物质和热量的转移以及均匀性等。研究人员通过研究证实溶氧、氮源、C/N比、以及矿物质和氨基酸的添加等因素都会影响菌丝的形态。Koike等[20]发现C/N比为15～20时，菌丝的形态最有利于ARA的积累。针对培养基的优化，国内外研究人员已经进行了大量的研究。Higashiyama等[21]研究了无机盐对M. alpina菌丝形态和ARA产量的影响，在添加一定无机盐优化的培养基中，ARA产量达9.8 g/L。Peng等[5]利用响应面分析法优化M. alpinaME-1生产ARA培养基成分，生物量达36.86 g/L，ARA产量达9.65 g/L。当在培养基中添加某些外源物质时，ARA产量也能得到进一步提高。Singh等[15]研究发现，添加黄豆粉和植物油可以显著提高生物量和ARA的产量，ARA最高达11.1 g/L。

目前，ARA发酵工艺优化的研究主要围绕补料分批发酵、溶氧控制、菌丝体老化以及两阶段发酵控制等方面展开。Hwang等[19]通过补料添加葡萄糖，并用NH4OH调节pH值，菌体干重提高了4倍，ARA的含量提高到 18.8 g/L。利用M. alpina发酵生产ARA可分为菌体生长及油脂积累2个阶段，油脂积累阶段采用菌丝体老化工艺则有利于ARA的快速积累。Jin等[22]对传统老化工艺进行改进，最终 ARA产量高达19.02 g/L，是传统工艺的1.55倍。ARA发酵过程中溶氧是一个限制因素，在补料生产过程中高浓度生物量的获得非常困难。针对此问题，通常采用大通气量和高搅拌输出功率相结合的方法，但该方法不利于丝状真菌发酵生产过程，因此研究新的供氧方式十分重要。Jin等[12]利用乙醇胁迫作用及两步法发酵来提高ARA产量，发酵5 d后将降低转速，提高通气量，延长了发酵稳定期。在第5天和第7天分别添加3%和2%的乙醇，ARA产量为19.8 g/L，达到世界领先水平。Peng等[6]采用正十六烷作为氧载体来提高发酵液中溶氧浓度 (DO)，通过在发酵培养基中添加正十六烷，发酵体系的传氧系数 (KLa)和DO值都大大提高，最终ARA产量达到15.9 g/L，比单一的两阶段转速控制发酵法提高了28.9%。

利用现代生物工程新技术，例如ARA生产菌株的诱变选育、发酵培养基和发酵工艺的优化以及发酵过程的实时调控等技术，最终ARA的产量能得到一定幅度的提高。但是，这些传统的操作手段并未能从ARA合成途径等深层次去指导发酵调控，从而进一步大幅度提高ARA产量。

3 ARA合成的关键酶及其遗传改造

从20世纪末开始，日本、英国等展开了对利用产油微生物生产PUFAs的研究。迄今为止，各国研究人员在利用M. alpina发酵产ARA机理方面的研究已经卓有成效，尤以日本京都大学 Shimizu教授实验室为代表。该实验室在利用M. alpina1S-4发酵产多不饱和脂肪酸的途径、关键酶以及基因工程育种等方面进行了非常详尽的研究[23]。

本实验室在研究过程中发现，C18脂肪酸累积量较高，尤其是硬脂酸 (C18:0) 和油酸 (C18:1) 的含量较高，导致最终ARA占总脂肪酸中的百分含量较低，降低了ARA的合成效率，这也是目前利用微生物发酵产ARA油脂的技术瓶颈。运用传统的发酵工程手段并不能较好地解决以上这些问题。因此，对ARA生物合成的代谢途径进行分析，并从分子水平或者代谢机理方面展开研究，有望实现富含ARA的油脂的高效生产。

3.1 ARA合成的关键酶

3.1.1ARA合成途径以及关键酶

微生物发酵合成 PUFAs的代谢途径如图 2所示。PUFAs生物合成[24]从油酸 (Oleic acid，OA) 开始，Δ12脂肪酸脱氢酶催化油酸形成亚油酸。亚油酸是合成亚麻酸的前体物质，在Δ6脂肪酸脱氢酶催化下形成γ-亚麻酸 (GLA)。GLA在碳链延长酶催化下，合成双高-γ-亚麻酸 (DGLA)，然后经Δ5脂肪酸脱饱和酶催化，将DGLA第5位碳原子上的氢脱除转化成 ARA。纵观 PUFAs合成途径[23]，脂肪酸脱饱和酶 (Desaturase)、碳链延长酶 (Elongase) 和NADH-细胞色素b5还原酶等酶都是ARA合成代谢途径中的关键酶。

长期以来脱饱和被认为是PUFAs生物合成过程中的限速步骤，因此绝大多数的研究都集中脱饱和酶基因的克隆与表达及其酶学性质研究等方面[25]。自20世纪90年代初，Shimizu教授的实验室就开始展开关于脱饱和酶酶学性质方面的研究。随后，Δ5脂肪酸脱饱和酶[26]、Δ12脂肪酸脱饱和酶[27]、Δ6脂肪酸脱饱和酶[28]等去饱和酶的功能逐一被揭开，并且获得了相应酶缺陷型菌株的特异产物。这些研究为全面剖析PUFAs的合成途径奠定了坚实的基础。然而近期的研究却表明，脱饱和并非ARA合成过程的限速步骤。2000年，Wynn等[29]证实碳链延长酶催化GLA合成DGLA才是ARA合成过程中的限速步骤。2005年，Takeno等[30]进一步从分子水平验证，该反应是M. alpina合成ARA过程中的限速步骤。因此，对碳链延长酶进行基因操作可以作为提高ARA产量的一条有效途径。不论脱饱和过程和延长过程两者哪一个步骤是限速步骤，这两种参与反应的酶都是 ARA合成途径中不可或缺的关键酶。而NADH-细胞色素 b5还原酶 (CbR) 作为电子传递链的一部分，参与多种酶反应，其中就包含脂肪酸乙酰辅酶A的去饱和反应以及延长反应[31]。因而，这个酶也是PUFAs合成过程中的一个关键酶。1999年，Sakuradani等[31]从M. alpina中成功克隆得到CbR的编码基因，通过序列比对发现该基因序列与其他来源 (如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae) 的 CbR基因序列类似。并且对M. alpinaCbR进行纯化，纯化后的CbR与NADPH相比，更偏爱NADH作为给电子体。随着关键酶方面研究的不断深入，经过多年研究的累积，研究人员对M. alpina合成ARA代谢途径已有比较清晰完整的认识。

图2 PUFAs生物合成代谢途径Fig.2 Pathways for the biosynthesis of PUFAs in microorganism. ΔN: ΔN desaturase; EL: fatty acid elongase.

3.1.2关键酶在不同体系中的表达

近些年，研究人员对ARA合成途径中的关键酶进行了大量系统的研究工作，克隆得到了关键酶的编码基因，并进一步将这些关键酶的基因在其他缺乏此类酶的生物体系中实现了表达。2001年，刘莉等[32]将M. alpinaATCC16266菌株体内Δ6脂肪酸脱氢酶克隆到酿酒酵母后，γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的含量达到 31.6%。该基因在酿酒酵母体系中表达量为国内外领先水平。2004年，李明春等[33]初步建立起Δ6脂肪酸脱氢酶在毕赤酵母中的表达体系，实现了M. alpinaΔ6脂肪酸脱氢酶在毕赤酵母中的表达，最终γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16.26%。2006年，Chen等[34]通过将Δ5、Δ6脱饱和酶和碳链延长酶基因在大豆种子中进行表达，在大豆油中累积了GLA、二十碳二烯酸 (EDA)、DGLA和ARA，提升了大豆油的品质。这种方法使得从产油植物中获得所需的PUFAs成为可能。

3.2M. alpina遗传操作系统

对 ARA生物合成代谢途径及关键酶的研究是开展基因工程育种研究的必要前提。随着人们对于ARA生物合成关键酶在分子水平上的认识逐步加深，利用基因工程手段改造 ARA生产菌株以提高ARA的发酵水平日益受到研究人员的青睐。为了高效使用基因工程技术，构建适合目的菌株的遗传转化系统是先决条件。目前，研究人员已成功构建多种高山被孢霉的转化系统，为日后基因工程育种方面的研究奠定了坚实的基础。

2000年，Mackenzie等[35]首次建立了M. alpinaCBS 224.37的转化系统，成功构建了pD4载体。该载体以同源his H4.1p为强启动子，修正的潮霉素B抗性基因hpt(mod) 为标记基因，采用PEG原生质体介导的方法成功地将载体导入宿主细胞，经潮霉素抗性筛选得到重组子。2004年，Takeno等[36-37]针对M. alpina1S-4菌株抗潮霉素的性状，首先利用诱变剂 MNNG对菌种进行诱变筛选出尿嘧啶缺陷菌株。嘧啶核苷酸合成途径中有 2个较关键的酶，即乳清酸磷酸核糖基转移酶 (OPRTase) 和乳清苷单磷酸脱羧酶 (OMPdecase)，ura5和ura3基因分别编码OPRTase和OMPdecase。通过对比分析缺陷型菌株与原始菌株中这两种酶活的变化，证实尿嘧啶缺陷菌株缺乏OPRTase，同时分离得到ura5基因。然后在pD4载体的基础上，建立了以ura5基因为选择性基因的pDura5载体。该载体以同源 his H4.1p作为强启动子、ura5基因为标记基因、异源丝状真菌的 trpCt为转录终止子。通过基因枪转化法导入M. alpina1S-4孢子，成功筛选到重组子。2009年，Ando等[38]构建了M. alpina1S-4的根癌农杆菌转化系统。该转化系统转化方法为根癌农杆菌介导法，载体仍然使用pDura5载体。这种方法转化频率高，且获得的转化子的有丝分裂稳定性比微粒轰击法更高。但是 Shimizu教授实验室构建的转化系统都需要筛选缺陷菌株，前期准备工作繁杂、工作量大、重复性不高，而且转化子具有生长速率低、产油率低等缺点。为了解决这些问题，构建简便易操作的M. alpina1S-4转化系统成为首要任务。2005年，Takeno等[39]通过实验验证，高浓度的争光霉素(20 mg/mL) 对M. alpina1S-4菌丝生长有抑制作用。2009年，Ando等[40]证实，100 μg/mL 萎锈灵能完全抑制M. alpina1S-4菌丝生长和孢子萌发。由此，分别建立 2种以原始菌株作宿主细胞的新型的转化系统，载体分别以zeo和sdhB基因为抗性基因。这2种新型转化系统的构建使得基因操作简便易行。

3.3M. alpina遗传改造

遗传转化系统的建立，为利用遗传改造M.alpina进一步提高PUFAs发酵水平奠定了基础。一些分子选育高产 ARA菌株的基因操作即建立在这些转化系统上。基因工程育种可以定向调控代谢产物的种类及产量。目前，通过基因工程手段提高M.alpina生物合成ARA水平的主要方法有：基因敲除、RNA干扰以及过量表达技术。

Sakuradani等[23,41]通过诱变筛选获得 Δ12脂肪酸脱氢酶缺陷型突变株M. alpinaJT-180，且测得该突变株中的Δ5和Δ6脂肪酸脱氢酶酶活性比原始菌株高。将 Δ12脂肪酸脱氢酶的基因在突变株M. alpinaJT-180中过表达，在相同的培养条件下，ARA产量比原始菌株提高66.7%，在总脂肪酸中的百分含量也提高了 18%。2005年，Takeno等[30]在pDura5载体上连接GLELO基因 (编码脂肪酸延长酶 EL2)，并成功导入目的菌株，使其催化 GLA向DGLA转化，因此ARA的产率得到了大幅度提高。相同培养条件下，ARA产量比原始菌株提高了近1倍。而脂肪酸延长酶EL1基因在M. alpina1S-4中过表达，也能加快ARA的合成速率并且提高ARA产量。碳链延长酶基因的过表达对M. alpina合成ARA有重要的影响。基于M. alpina基因水平上的深入研究，推动了研究人员对于ARA合成的代谢机理方面的认识。

本实验室长期以来主要在发酵调控方面对ARA的合成进行研究，并且取得了一定的成果。通过对培养基和发酵条件的优化，ARA的产量已经达到世界领先水平。但是通过对样品分析，我们发现 C18脂肪酸百分含量比 ARA百分含量高，甚至高出许多。针对该问题，本实验室拟进一步开展基因工程方面的研究，对ARA生产菌株的某些位点酶进行改造，从深层次把握整个ARA生物合成代谢途径，来进一步提高ARA产量。

4 展望

随着对微生物发酵法生产 ARA一系列关键性问题的解决，ARA必将大规模走向产业化。ARA发酵生产中，还存在着葡萄糖转化率低 (5%～10%)、生长周期长 (7～12 d) 和发酵过程难以控制等问题，这主要是由于ARA的生物合成机制十分复杂，从葡萄糖至ARA的合成涉及20多步酶促反应。

传统的发酵调控 (例如培养基优化、溶氧、pH调控等) 无法对ARA合成进行有针对性的、定向的调控。从基础科学问题上看，由于ARA产生菌多为非模式微生物，对其遗传背景的不了解以及对整个脂肪酸代谢网络的认识不够，导致发酵调控的盲目性以及不稳定性。1991年，Bailey教授在Science上发表文章[42]，首次详细论述了代谢工程，标志了代谢工程新学科的诞生。其与细胞生物学、基因工程等技术的联合应用已成为研究和控制微生物生长代谢的一个必不可少的手段。因此，对ARA发酵过程有必要利用先进的代谢工程方法对整个脂肪酸网络进行系统的分析研究，利用代谢流分析和代谢流控制、优化等理论指导发酵调控，在全局代谢网络调控的基础上实现脂肪酸生产与菌体生长之间的平衡，以期达到ARA产量最大化。

获得一株性状优良的生产菌株是 ARA发酵生产的关键。在国内外研究中，尽管利用基因工程技术对菌株进行改造能在一定程度上提高发酵水平，但是总体而言收效甚微。因而，选育高效的ARA高产菌株必定成为未来研究的重点。全局转录机器工程[43]和多基因组工程[44]等新兴发展的工业微生物育种技术，能深入到转录水平和基因组水平对菌株进行选育，成为研究人员热点关注的对象。因此，在未来的研究中，利用新技术选育高产菌株必将成为一种趋势，从而更好地为工业生物技术产业的发展服务。

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Progress in production of arachidonic acid byMortierella alpinaand genetic modification

Leilei Cong, Chao Peng, Xiaojun Ji, Zhiyong Li, Jiangying You, Jinmiao Lu, and He Huang

State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering,College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing210009,China

Received:May 4, 2010;Accepted:July 12, 2010

Supported by:Key Program of National Natural Science Foundation of China (No. 20936002), National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (Nos. 2007CB707805, 2009CB724700), the Fifth of Six Projects Sponsoring Talent Summits of Jiangsu Province (No.2008-D-63), College Industrialization Project of Jiangsu Province (No. JH09-30), Program for Century Excellent Talents in University from the Ministry of Education of China (No. NCET-09-0157), the Fok Ying Tung Education Foundation, Ministry of Education of China (No. 123014).

Corresponding author:He Huang. Tel/Fax: +86-25-83172094; E-mail: biotech@njut.edu.cn

国家自然科学基金重点项目 (No. 20936002)，国家重点基础研究发展计划 (973计划) (Nos. 2007CB707805, 2009CB724700)，江苏省六大人才高峰项目 (No. 2008-D-63)，江苏省高校科研成果产业化推进项目 (No. JH09-30)，教育部新世纪优秀人才计划 (No. NCET-09-0157)，教育部霍英东教育基金 (No. 123014) 资助。