微生物法生产1,3-二羟基丙酮代谢工程研究进展

孙丽慧，胡忠策，郑裕国，沈寅初

浙江工业大学生物工程研究所，杭州 310032

代谢工程

微生物法生产1,3-二羟基丙酮代谢工程研究进展

孙丽慧，胡忠策，郑裕国，沈寅初

浙江工业大学生物工程研究所，杭州 310032

1,3-二羟基丙酮是一种重要的化工原料和医药中间体，广泛应用于化妆品、医药、食品等领域。以下综述了微生物法生产 1,3-二羟基丙酮的代谢途径和关键酶，以及微生物法生产 1,3-二羟基丙酮所涉及的代谢工程技术的研究进展。指出利用基因工程的方法对菌株进行改造，提高甘油脱氢酶催化活性，同时根据菌株的代谢特性，对发酵过程进行调控，提高1,3-二羟基丙酮的得率，是今后的研究方向。

1,3-二羟基丙酮，代谢工程，发酵，甘油

Abstract:1,3-Dihydroxyacetone is widely used in cosmetics, medicines and food products. We reviewed the recent progress in metabolic pathways, key enzymes, as well as metabolic engineering for microbial production of 1,3-dihydroxyacetone. We addressed the research trend to increase yield of 1,3-dihydroxyacetone by improving the activity of glycerol dehydrogenase with genetic engineering, and regulating of fermentation process based on metabolic characteristic of the strain.

Keywords:1,3-dihydroxyacetone, metabolic engineering, fermentation, glycerol

1,3-二羟基丙酮 (1,3-Dihydroxyacetone，DHA)是最简单的酮糖，外观是白色粉末状结晶，有甜味，易溶于水、乙醇、丙酮和乙醚等溶剂。一般状态下是以二聚体 (1,4-Dioxane) 结晶的形式存在，但经过溶解或加热则变成单体[1]。由于DHA分子中具有3个官能团，其化学性质活泼，可参与多种反应，因而作为重要的化学合成中间体和多功能试剂，在化工、医药、食品等领域有着广泛的应用[2]。DHA 的生产方法有化学法和微生物法[3-5]。化学法合成DHA需要价格较高的原料或者较昂贵的金属催化剂，原料利用率低，导致生产成本较高，且对环境污染严重；而微生物法具有对环境友好、专一性强、反应条件温和、底物利用率高等优点，越来越受到人们的广泛重视。微生物法生产DHA相比化学合成法而言，既符合绿色化工的要求，又可避免化学合成的困难，同时可以实现人类社会生产由传统的以不可再生化石资源为原料的石油炼制向以可再生生物质资源为原料的生物炼制转型。

1898年Bertrand首先报道了甘油微生物法生产DHA[3]。自上世纪 50−60年代起，各国科研人员逐步展开了微生物法生产DHA的研究，并不断深入，研究内容主要涉及到菌种的诱变筛选、发酵工艺的优化、发酵底物和产物对DHA合成的影响、反应动力学等[6-8]。在国内，我们于 2001年率先报道了微生物法转化甘油生产DHA的研究[9]，并开展了发酵工艺优化、产业化放大等研究工作，已取得了较好的研究开发成果[5,9-13]。目前国内外学者在代谢工程技术应用于微生物产 DHA方面的研究也取得了一定的进展，可以预计对提高DHA的生产水平具有重要作用。

1 微生物代谢产DHA的途径及关键酶

目前研究发现，很多微生物都能够利用甘油或甲醇为底物代谢产生 DHA，利用微生物代谢产生DHA通常有两种途径。一种产生DHA路线是以甘油为底物，利用微生物代谢产生的甘油脱氢酶，将甘油分子结构中2位C 上的羟基进行脱氢反应，转化成DHA；另一种产生路线是以甲醇为底物，首先将甲醇氧化生成甲醛，然后与 5-磷酸木酮糖在二羟基丙酮合成酶的作用下生成DHA和3-磷酸甘油醛。

能够产生甘油脱氢酶 (GDH) 的微生物，如大肠杆菌Escherichia coli[14]、氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans[10,15]、木醋杆菌Acetobacter xylinum[16]和产气克雷伯氏菌Klebsiella aerogenes[17]等，它们都能将甘油代谢转化生成DHA；能够产生二羟基丙酮合成酶 (DHAS) 的甲基营养型酵母[18]，如多形汉逊酵母Hansenula polymorpha和博伊丁假丝酵母Candida boidinii等，能够以甲醇作为底物，生成DHA；另外还有部分甲基营养型酵母既能够产生甘油脱氢酶，又能产生二羟基丙酮合成酶，如Liu等[13]从土壤中分离得到一株膜璞毕赤酵母Pichia membranifaciens，在初始甘油浓度为40 g/L的培养基中，可获得DHA 13.57 g/L。在上述所有产DHA的微生物中，有关氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans的研究报道最多，该菌种生产性能稳定，甘油生成DHA的转化率高，是目前用于工业化生产的主要菌株。

微生物中的甘油脱氢酶 (Glycerol dehydrogenase，GDH) 按照其依赖辅酶的情况可划分为3种类型[19]：第一种为依赖NAD+的GDH (EC1.1.1.6)，主要存在于细胞质中，它将甘油转化为DHA后，DHA进一步磷酸化，进入糖酵解和三羧酸循环途径，为微生物生长提供能量。GDH (EC1.1.1.6) 存在于多种细菌的细胞质中[19]，如E. coli、弱氧化醋杆菌Acetobacter suboxydans和克雷伯氏肺炎杆菌Klebsiella pneumonia等。第二种GDH (EC1.1.1.72和EC1.1.1.156) 需要以NADP+作为辅酶因子，这类GDH大多存在于霉菌和动物组织中，如构巢曲霉Aspergillus nidulans、粗糙脉孢霉Neurospora crassa、米曲霉Aspergillus oryzae、深绿木霉Trichoderma aureoviride等[20]，可将甘油氧化为 DHA或甘油醛。第三种 GDH(EC1.1.99.22) 既不依赖NAD+、也不依赖NADP+，主要存在于葡萄糖酸杆菌属 (氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter oxydans、弱氧化葡萄糖酸杆菌Gluconobacter suboxydans等) 的细胞膜上[21-22]。

在G. oxydans中，GDH (EC1.1.1.6) 和 GDH(EC1.1.99.22) 往往同时存在。G. oxydans代谢甘油产生DHA主要有两条氧化途径 (图1)[22-23]。第一条代谢途径是不需要ATP和辅酶因子NAD+，甘油可被细胞膜上的甘油脱氢酶一步直接氧化成DHA，这一过程的电子传递链由泛醌、细胞色素O和细胞色素O还原性酶组成，氧作为电子受体，并且该电子传递链与ADP氧化磷酸化形成ATP的过程相耦合，当细胞中糖酵解途径及三羧酸循环途径缺乏时，这条途径可为细胞生长及其他代谢过程提供所需的能量；第二条代谢途径是甘油进入细胞后，在细胞质中甘油脱氢酶的作用下生成DHA，然后在二羟丙酮激酶作用下转变为磷酸二羟丙酮 (DHAP)，或者甘油在磷酸激酶作用下磷酸化成甘油-3-磷酸(Glycerol-3-P)，然后经细胞质内甘油-3-磷酸脱氢酶作用转变成 DHAP，再进入磷酸戊糖循环途径，这一过程需要 ATP，也需要辅酶因子 NAD+。在正常情况下，微生物细胞在以甘油作为唯一碳源培养基上生长时，细胞质中代谢是其能量的主要来源。在没有抑制剂或去耦合试剂存在时，甘油既在细胞膜上代谢也在细胞质中代谢。

图1 氧化葡萄糖酸杆菌代谢甘油的途径Fig.1 Pathways of glycerol metabolism inG. oxydans.

以往研究发现，高浓度基质甘油和高浓度产物DHA都会抑制甘油脱氢酶的活性，进而对发酵过程产生不利的影响。Bories等[24]研究发现，当初始甘油浓度从50 g/L提高到100 g/L，菌体生长和DHA生成能力都明显下降。Ohrem等[25]发现，高浓度的DHA会抑制细胞膜系的甘油脱氢酶的活性，当DHA浓度达到61 g/L时，菌体停止生长，当DHA浓度达到108 g/L时，甘油停止转化。为有效消除底物的抑制作用，Bauer等[15]研制开发出一种新型的半连续两阶段反复补料发酵工艺，最终可获得高达220 g/L的DHA，这是目前国内外所报道的最高产量。

微生物代谢甘油产生DHA的关键酶是GDH，因此，除了直接发酵法或静息细胞催化法，也可以直接利用从微生物细胞中提取获得的 GDH作为催化剂。然而，利用 GDH (EC1.1.1.6) 酶催化甘油生产DHA的反应需要以NAD+作为辅酶，辅酶的价格昂贵，而且生成的还原型辅酶NADH是NAD+的竞争性抑制剂[26]，因此有必要对辅酶进行循环再生。近年来，学者们开始考虑利用双酶耦联反应来解决酶催化过程中的辅酶再生问题。方柏山等将 GDH(EC1.1.1.6) 和 1,3-丙二醇氧化还原酶 (PDOR) 相耦合，以3-羟基丙醛和甘油为底物，利用GDH将甘油还原成DHA产生NADH，而PDOR氧化3-羟基丙醛生成1,3-丙二醇和NAD+，该方法实现了辅酶的再生，并大大提高了产品得率，在分批操作条件下，该酶耦联催化反应产物得率都接近1 mol/mol[27]。然而，底物 3-羟基丙醛稳定性差，并且酶的分离提纯过程也相对繁琐。在该研究基础上，Nemeth等[28]提出了一个相对更为经济的微生物酶催化反应过程(图2)，即在膜反应器中，利用甘油为底物，加入超声破碎K. pneumoniae细胞和丁酸梭菌Clostridium butyricum细胞获得的粗酶甘油脱水酶 (GDHt)、PDOR和GDH，进行酶催化反应，同时实现辅酶的再生。目前与辅酶再生相关的酶耦联催化技术仅在实验室中探索研究，在大规模生产上还受到一定的限制。

图2 酶耦合催化甘油合成1,3-丙二醇和1,3-二羟基丙酮Fig.2 Enzymatic bioconversion of glycerol to PD and DHA.

2 代谢工程技术在微生物产DHA中的应用

近年来，随着生物工程技术的迅猛发展，代谢工程技术已经在生物医药、生物基化学品和生物能源等诸多领域展开了广泛的应用。代谢工程(Metabolic engineering) 是利用分子生物学原理系统分析代谢途径，设计合理的遗传修饰战略来定向改善细胞的特性，或运用重组DNA技术来构建新的代谢途径[29]。国内外学者将代谢工程技术应用于微生物生产DHA的研究工作主要包括两个关键方面：1) 过量表达甘油脱氢酶基因，改善微生物细胞已有的代谢网络；2) 将甘油脱氢酶基因在模式宿主菌中表达，构建新的代谢途径或拓宽菌株的底物利用范围。

基于微生物代谢途径和代谢功能的解析，在重组 DNA技术基础之上改善微生物细胞中已有的代谢网络和表达调控网络，实现生物加工过程的高效率，是代谢工程的重要内容之一[30]。根据微生物代谢产生DHA的途径，DHA的微生物法生产无论采用直接发酵技术还是利用生物催化 (整体细胞、酶)技术，其核心的问题是改善微生物细胞性状，提高关键酶的表达。分子生物学的发展已经能够构建出DHA产生途径中的甘油脱氢酶 GDH过量表达的基因工程菌，成为DHA微生物法生产的重要研究方向。而过量表达目的基因，强启动子是必不可少的[31]。Gatgens等分别利用强启动子tufB和gdh使G. oxydans膜系脱氢酶sldAB基因过量表达，不但提高了菌体生长的密度，还明显提高了DHA浓度和转化率。以 550 mmol/L甘油为底物，微生物法生产DHA的产量可以达到350 mmol/L，DHA产量比普通菌提高了75%[32]。为缩短克隆周期，提高克隆效率，Schleyer等构建了pEXGOX克隆和表达载体系统，该系列载体较小，仅为5.7 kb，序列结构明确，易于操作和改造，具有tufB强启动子，能高效克隆和表达G. oxydans基因，并可以直接克隆平末端PCR产物[33]。

除将G. oxydans中甘油脱氢酶过量表达以外，也有学者考虑利用基因重组技术在宿主菌中表达异源甘油脱氢酶基因来提高DHA的产率。大肠杆菌和酿酒酵母菌是目前最常用基因工程宿主菌，它们的生理和遗传机制、基因组信息、代谢网络模型都研究的比较透彻[29]，同时大肠杆菌和酿酒酵母本身都具有代谢产生DHA的甘油脱氢酶，只是产DHA的能力很低。因此，以它们为宿主细胞，结合有效的遗传操作技术，改造后的菌种产DHA能力能够显著提高。魏东芝等研究以沙门氏菌、克雷伯氏菌、醋酸杆菌、志贺氏菌、大肠杆菌或氧化葡萄糖杆菌基因组 DNA为模板，PCR扩增获得编码甘油脱氢酶基因gdh和编码NADH脱氢酶基因ndh，利用PET系列表达载体分别构建基因工程质粒 pET-gdh和pET-ndh，并将其分别或共同转入大肠杆菌中。利用该重组菌代谢甘油生产DHA，提高了DHA的产率，同时收集到的菌体经处理后可重复利用[34]。

代谢工程技术在 DHA生产中应用的另一个重要方向是根据微生物代谢甘油产 DHA的途径和关键酶，从降低DHA的生产成本角度考虑，利用基因工程技术改造菌种，改变微生物的代谢性能，使其将底物食谱扩展到诸如葡萄糖和淀粉之类廉价而丰富的可再生原料，这也是DHA规模化生产使其在同类产品中更具竞争力的一个研究方向，值得我们予以特别关注。Nguyen等提出了利用能够代谢葡萄糖产生甘油的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae为出发菌株，并导入能够表达甘油脱氢酶的外源基因，以实现利用葡萄糖为底物来发酵生成DHA (图3)。作者分别将来源于H. polymorpha和E. coli中的甘油脱氢酶基因在S. cerevisiae中进行表达，构建转化甘油生成DHA的途径，结果表明来源于H. polymorpha依赖 NAD+的甘油脱氢酶基因在酵母中表达后，其催化活力相对较高，在葡萄糖浓度为20 g/L的摇瓶中发酵培养，DHA浓度可达100 mg/L，是野生株产量的5倍；此外，为阻断DHA进一步被二羟丙酮激酶转化生成 DHAP，作者还研究了将编码二羟丙酮激酶的基因DAK1/DAK2敲除 (图3)，同时过量表达H. polymorpha甘油脱氢酶基因，在同样发酵条件下，DHA产量可提高到700 mg/L[35]。与国内外文献所报道的DHA发酵最好水平相比，虽然当前利用工程菌生产DHA的发酵水平还相对较低，但这些研究反过来对代谢工程方法应用于 DHA生产产生了有力的推动作用，为该领域研究提出了一个很好的发展方向。

图3Saccharomyces cerevisiae利用葡萄糖产1,3-二羟基丙酮的代谢途径和工程育种策略Fig.3 Metabolic pathways and engineering strategy for the production of DHA from glucose inSaccharomyces cerevisiae.FBP: 1,6-fructose bisphosphate; GAP: glyceraldehydes 3-phosphate;DHAP: dihydroxyacetone phosphate; G3P: glycerol 3-phosphate.

3 总结与展望

甘油作为生物柴油的主要副产物，其下游产品有DHA、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、丙烯醛、乙二醇、3-羟基丙酸、3-羟基丙醛、环氧氯丙烷等，其中DHA作为一种重要的化工原料和医药中间体，其后续衍生产品种类很多，且衍生产品市场容量大，因而DHA的市场潜力很大。

目前，微生物发酵法工业化生产DHA主要分布在美国、日本、德国。我国虽然起步相对较晚，但近年来也取得了喜人的研究成果。魏东芝教授课题组在微生物细胞固定化产 DHA和基因重组工程菌方面做了很多研究工作[8,34]。我们所在团队的浙江工业大学生物工程研究所近十余年来对微生物法生产DHA也做了大量的工作，包括建立了产DHA菌株的快速筛选模型[5]；对筛选得到高产DHA的微生物菌株G. oxydans在发酵过程中的代谢特性进行研究，通过分阶段培养来控制代谢流的分配，提高了目标产物浓度和转化率；同时对产物后续分离工艺也进行了研究，能够得到高纯度的DHA产品，符合化妆品添加剂、医药中间体等质量指标。现已在浙江海正药业股份有限公司完成10 t发酵罐规模的生产性试验，构建了年产1 000 t的DHA生产线，在生产规模下产物浓度达到250 g/L以上，并且还有进一步提升的潜力和空间，发酵水平明显高于目前国内外报道的最好水平 (采用半连续两阶段反复补料发酵工艺，最终可获得高达220 g/L的DHA)[15]。我们将这些研究成果已经成功地进行了产业化，生产菌种和生产工艺拥有自主知识产权[36-39]，技术指标达到国际领先水平，产品已经在浙江海正药业股份有限公司开始生产和销售。

综观国内外的研究现状，尽管对微生物法生产DHA的研究取得了一定的进展，DHA的发酵技术已经推上了产业化，但代谢工程技术应用在微生物生产DHA的研究报道还不多见，仍有许多研究和开发工作有待进行。一方面，可以利用基因工程的方法对菌株进行改造，提高甘油脱氢酶催化活性，并使其耐受高浓度底物和产物；另一方面，根据微生物的代谢特性，对发酵过程进行代谢调控，合理地设计发酵工艺，增加DHA途径的代谢流分配，使底物甘油最大程度地转化为DHA，减少代谢过程中的副产物，这样既可以提高产物浓度，又降低了分离成本。同时，还要充分开发 DHA下游产品，拓宽DHA的应用范围。

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Progress in metabolic engineering of microbial production of 1,3-dihydroxyacetone

Lihui Sun, Zhongce Hu, Yuguo Zheng, and Yinchu Shen

Institute of Bioengineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou310032,China

Received:April 22, 2010;Accepted:July 7, 2010

Supported by:National Basic Research and Development Program of China (973 Program) (No. 2007CB714306), Key Research and Development Project of Zhejiang Province (No. 2008C01014-2).

Corresponding author:Yuguo Zheng. Tel: +86-571-88320614; Fax: +86-571-88320630; E-mail: zhengyg@zjut.edu.cn

国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2007CB714306)，浙江省重大科技专项 (No. 2008C01014-2) 资助。