海参肠道组织蛋白酶B粗酶提取条件的优化

于 蕾， 朱 蓓 薇， 孙 黎 明， 周 大 勇， 秦 磊

( 大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

海参(Sea cucumber) 富含大量生物活性成分，如黏多糖、皂苷、β-胡萝卜素、海胆紫酮、牛磺酸等，具有极高的营养和药用价值。但海参具有很强的自溶能力，给运输与加工造成不便及经济损失[1]。有报道指出，海参消化道内存在的内源性蛋白酶是自溶的主导因素。2004年，本实验室对海参自溶酶的分离纯化及性质进行了初步研究[2]，之后，对海参体壁组织蛋白酶[3]、酸性磷酸酶[4]及海参肠道β-1,3-葡聚糖酶进行了系列研究，为海参自溶酶机制研究奠定了一定基础。

组织蛋白酶B是存在于溶酶体中的一类半胱氨酸蛋白酶，属巯基蛋白酶，具有内肽酶活[6-7]及羧肽酶活[8]。目前，对组织蛋白酶B的研究主要集中在鱼类，已从非洲鲗鱼、鲐鱼、大马哈鱼、鲤鱼等中纯化得到组织蛋白酶B。赵露露等[9]提取了海参体壁组织蛋白酶B粗酶并对酶学性质做了研究。有关海参肠道组织蛋白酶B的研究尚未见报道。本研究对海参肠道组织蛋白酶B粗酶的提取条件进行了优化，以期为进一步研究组织蛋白酶B的纯化及酶学性质提供条件。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 原 料

新鲜、组织完整、无自溶的海刺参个体。

1.1.2 试 剂

N-苄酯基-精氨酸-精氨酸7-酰胺基4-甲基香豆素(N-Carbobenzoxy-Arg-Arg-MCA，Z-Arg-Arg-MCA)，7-酰胺基4-甲基香豆素(7-amido-4-methycoumarin，MCA)，美国Sigma公司；牛血清白蛋白，Fluka Switzerland；二硫苏糖醇(DTT)、L-半胱氨酸(L-Cys)、氯乙酸、Triton X-100、二甲基亚砜(DMSO)，上海生工生物工程有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙酸钠、乙酸，均为分析纯、市售。

1.1.3 仪 器

荧光光谱仪，Lambda 35紫外光谱仪，美国PE公司；Z-323K冷冻离心机，德国HERMLE；SP-756紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；超低温保存箱(-80 ℃)，日本三洋公司；8050型超滤装置，超滤膜截留分子质量10 ku，Millipore公司。JJ200Y型精密电子天平，美国双杰兄弟集团有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；1810D自动双重纯水蒸馏器，上海申生科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 样品前处理

新鲜海刺参取其肠，去除泥沙，称取50 g，剪成2～3 cm的小段，加入4 ℃的200 mL浸提缓冲液，于4 ℃匀浆，充分破碎。

1.2.2 Lowry法测定蛋白质的质量浓度

采用Lowry法测定蛋白质的质量浓度[10]。以牛血清蛋白质量浓度(μg/mL)为横坐标，光密度值OD500为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线为Y=0.003 5X+0.012 8(R2=0.997 7)。

1.2.3 荧光法测定酶活力

1.2.3.1 紫外光谱法确定底物标准品MCA的最大吸光度值

全波长扫描，检测底物标准品MCA的最大吸光度值。最大紫外吸收值处波长为346 nm。

1.2.3.2 荧光光谱法确定MCA最大荧光强度值

用DMSO将MCA配成10 mmol/L贮备液，激发波长为346 nm的条件下，测定MCA的最大荧光强度值，MCA的最佳发射波长为439 nm。

1.2.3.3 MCA标准曲线的绘制

以MCA浓度(μmol/L)为横坐标，439 nm下的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线为Y=892.48X+5.502 4(R2=0.999 8)。

1.2.3.4 酶活力的测定

按照Keyszer等[11]提供的方法进行测定，并略作修改。

反应缓冲溶液：340 mmol/L乙酸钠、60 mmol/L乙酸、4 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(pH 5.5)，使用前配制成含8 mmol/L DTT的新鲜溶液。

终止液：100 mmol/L乙酸钠、100 mmol/L乙酸和100 mmol/L 氯乙酸(pH 4.3)。

取待测酶液150 μL，加入75 μL组织蛋白酶B反应缓冲溶液后在40 ℃水浴中孵育2 min，再加入75 μL底物，40 ℃孵育20 min，取出后立即加入300 μL终止液终止反应，采用荧光光度法测定酶活力。将MCA作为酶活力测定的标准品。空白对照为先加入终止液后，再加入酶液。

酶活力定义：能够在1 min内水解底物并释放出1 μmol/L MCA产物的量作为一个酶活力单位[MCA 1 μmol/(L5min)]。

1.2.4 浸提缓冲液对提取组织蛋白酶B的影响

大多数蛋白酶在低离子强度以及偏酸性的缓冲液中具有较大的溶解度。分别称取50 g处理后的新鲜海参肠样品3份，分别加入浓度为50 mmol/L的pH 3.0的NaAc-HAc缓冲液、pH 5.0的NaAc-HAc缓冲液和pH 6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液各200 mL中浸提。上述浸提缓冲溶液均含5 mmol/L L-Cys和1 mmol/L的EDTA。

1.2.5 浸提时间对提取组织蛋白酶B的影响

匀浆液于4 ℃下分别静置浸提1～12 h后，于13 500 r/min冷冻离心20 min。分别收集上清液，进行蛋白质质量浓度和酶活力的测定。

1.2.6 硫酸铵饱和度对提取组织蛋白酶B的影响

在最佳浸提缓冲液和最佳浸提时间提取海参肠组织蛋白酶B，经13 500 r/min冷冻离心20 min后，取上清液，在4 ℃磁力搅拌下加入硫酸铵，使其饱和度分别达到0、20%、40%、60%、70%、80%、90%，静置4 h后，13 500 r/min冷冻离心20 min，取上清液并分别测定酶活力。

1.2.7 透析与浓缩

硫酸铵盐析法获得的沉淀经适量蒸馏水溶解，采用7 ku透析膜于4 ℃的蒸馏水中充分透析后，用截流分子质量为10 ku的超滤膜进行超滤浓缩，超滤时可循环加少量的去离子水以利于除盐，浓缩好的酶液即为粗酶液，于-80 ℃贮存备用。

1.2.8 酶与巯基保护剂作用的研究

于获得的粗酶液中分别加入EDTA、L-Cys、DTT、EDTA-L-Cys混合液、EDTA-DTT混合液，使EDTA的终浓度为1 mmol/L，L-Cys和DTT的终浓度为2 mmol/L，L-Cys和DTT的终浓度均呈梯度变化：依次为0.5、1.0、2.0、5.0、10、20 mmol/L。

将上述混合酶液在室温下孵育30 min后，测定酶活力。

2 结果与讨论

2.1 最适浸提缓冲液的确定

组织蛋白酶B是存在于细胞溶酶体中的一类半胱氨酸蛋白酶。研究表明，其在弱酸性环境下易被活化，在pH 3.0～7.0 均具有活性，而在碱性条件下会发生不可逆失活。由图1可知，50 mmol/L pH 5.0的NaAc-HAc缓冲液提取的粗酶相对酶活最高，pH 6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液提取的相对酶活最低，因此含5 mmol/L L-Cys、1 mmol/L EDTA、0.2% Triton X-100的50 mmol/L pH 5.0的NaAc-HAc的缓冲液是提取组织蛋白酶B的最佳浸提缓冲液。

1. pH 3.0 NaAc-HAc缓冲液；2. pH 5.0 NaAc-HAc缓冲液；3. pH 6.8 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液

2.2 最佳浸提时间的确定

由图2可知，浸提时间在6～10 h时，酶活力达到最大，且酶活力基本保持不变，说明酶处于相对稳定的状态；当浸提时间大于10 h时，酶活力明显变小；而蛋白质含量随浸提时间的延长逐渐增大，浸提时间在1～7 h时，蛋白质含量明显增大，当浸提时间为7 h时，蛋白质含量基本达到最大，之后蛋白质含量基本保持不变，达到平衡。由于组织蛋白酶是一种结构较复杂的蛋白酶，本实验为避免不同酶形式呈现不同酶活力的干扰，因此选择酶活趋于平衡的状态，以最大限度保证酶形式一致。因此选择7 h作为海参肠提取组织蛋白酶B的最佳浸提时间。

图2 浸提时间对组织蛋白酶B提取率的影响Fig.2 Effect of different time on extracting efficiency of cathepsin B

2.3 最适硫酸铵饱和度的确定

由图3可知，随着硫酸铵饱和度的增加，上清液的酶活逐渐减小。当硫酸铵饱和度由50%增加至70%时，上清液的酶活急剧下降；当硫酸铵饱和度达到80%时，上清液的酶活趋近于零，且与硫酸铵饱和度90%时基本持平，说明80%硫酸铵饱和度已将海参肠组织蛋白酶B基本全部沉淀，因此以80%硫酸铵饱和度作为组织蛋白酶B最佳盐析条件。

图3 组织蛋白酶B硫酸铵盐析曲线Fig.3 Salting out curve of cathepsin B

2.4 巯基保护剂对酶活力的影响

由表1可知，金属螯合物EDTA和EGTA及巯基保护剂DTT和L-Cys对酶均有一定的激活作用。当L-Cys终浓度在0.5～5 mmol/L时，酶活逐渐变大；当其终浓度达到5 mmol/L时，酶活基本保持不变。而随DTT终浓度由0.5～20 mmol/L梯度变化时，酶活也逐渐增大，可见DTT对酶的激活作用较为明显。说明提取的粗酶液含有巯基基团，符合组织蛋白酶B的特性。因此，巯基保护剂可有效地保护酶活，可用于组织蛋白酶B的提取、纯化等。

表1 巯基保护剂与金属螯合物对组织蛋白酶B酶活的影响Tab.1 Effect of sulfhydryl and metal chelating reagents on cathepsin B

3 结 论

海参肠道组织蛋白酶B粗酶最优提取条件为：含5 mmol/L L-Cys、1 mmol/L EDTA、0.2% Triton X-100的50 mmol/L pH 5.0 的NaAc-HAc缓冲液匀浆破碎浸提7 h后，选择80%的硫酸铵饱和度盐析。该方法可获得具有较高酶活的粗酶，还可有效减少分离纯化过程中组织蛋白酶B活性的降低。

巯基保护剂可激活提取的粗酶液，说明提取的粗酶含有巯基，这符合组织蛋白酶B的特性。因此在提取粗酶的过程中，可添加巯基保护剂以有效保证酶活性。

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