发酵产薯蓣皂苷酶的反应条件

王 颖，富瑶瑶，刘廷强，鱼红闪，金凤燮

（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

黄姜（DioscoreazingiberensisC.H.Wright）为盾叶薯蓣的根茎，多年生缠绕草本，有地下块茎。其有较高的药用和化工价值，是一种市场需求比较稳定的药材［1］。黄姜中含有薯蓣皂苷，具有祛痰、脱敏、抗炎、降脂、抗肿瘤等作用；其苷元是合成甾体激素类药物的重要原料［2-4］。黄姜根状茎中薯蓣皂苷量达10%左右，是重要的薯蓣皂苷元来源经济作物。国际上的薯蓣皂苷元主要由我国提供，我国现有的生产薯蓣皂苷元工艺采用黄姜全料酸解，使用的盐（硫）酸量大，造成污水量大，COD浓度高，并且酸降解的有机物质多，对环境造成巨大污染，难以处理，因而使用生物法水解皂苷生产苷元已成为必然之势［5］。本实验室已经对薯蓣皂苷转化为薯蓣皂苷元的方法、薯蓣皂苷酶的分离纯化及薯蓣皂苷酶解产物的分离纯化等做了大量研究［6-9］。本文在上述研究基础上研究微生物发酵产薯蓣皂苷酶水解薯蓣皂苷成苷元的最适酶反应条件，探讨通过酶转化法提高薯蓣苷元产量的可能性。

1 材料与方法

1.1 材 料

黄姜，产地陕西咸阳；黄姜薯蓣皂苷，总皂苷从黄姜根茎中提取；薯蓣皂苷元标准品，产地陕西；细菌Arthrobactersp.No.3菌（No.3菌）和细菌Rhodopseudomonassp.No.18菌（No.18菌），由韩国KAIST大学提供；Absidiasp.s00菌和Aspergillusoryzaesp.c42菌，由大连工业大学生物与食品工程学院菌种保藏所提供；薄层层析板Silica Gel 60-F254，德国Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1 培养基制备

胰蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，黄姜2g，水1 000mL。取20mL液体培养基，在121℃、0.1MPa下高温高压灭菌20min。

1.2.2 黄姜薯蓣皂苷酶的发酵与提取

将已灭过菌的培养基，在无菌环境下分别接入No.3菌、No.18菌、sp.s00菌、sp.c42菌，每瓶接2～3环。30℃恒温培养6～7d后，用0.02mol／L pH 5.0的NaAc-HAc缓冲溶液，离心得到的上清液加入硫酸铵或者有机溶剂沉淀酶。冷冻离心、收集沉淀，用适当量的NaAc-HAc缓冲液使其溶解。再次离心除未溶物，所得上清液即为酶液。

1.2.3 薯蓣皂苷的酶解

取0.2g薯蓣皂苷用NaAc-HAc缓冲液配成2mg／mL溶液，取0.1mL此溶液至1mL离心管中，加0.1mL酶液，于快速混匀器充分混匀后盖塞，置于40℃恒温箱内进行酶解反应。反应结束，加0.2mL水饱和正丁醇终止反应，充分摇晃后放置过夜或离心，所得上清液即可用作TLC分析。

1.2.4 薯蓣苷元纯度检测

薄层层析：薄层层析板Silica Gel 60-F254上点样，展开剂为V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶2.5∶0.5；10%的硫酸显色。

色谱仪，美国Waters 2695Separations Module；检测器，美国Waters 2996Photodiode Array Detector；色谱柱，C-18Hypersil ODS 25μm（4.6mm×150mm）；工作温度，20℃；柱温，35℃；体积流量，1.0mL／min；样品进样量，10μL；检测波长，270nm。流动相：V（乙腈）∶V（水）=7∶3，均为色谱纯。样品预处理：取样品及标准品各1mg，分别溶于1mL色谱甲醇中，进样前用0.45μm微孔滤膜过滤，并经超声处理。

2 结果与讨论

2.1 薯蓣皂苷酶高产菌株的选择

采用细菌No.3，细菌No.18，真菌Absidiasp.s00，真菌sp.c42进行发酵培养，对其产薯蓣皂苷糖苷酶的水解能力进行测定。发酵所得酶液分别对薯蓣皂苷进行酶解反应，通过观察薯蓣皂苷元生成情况选择薯蓣皂苷酶高产菌株，TLC检测见图1。

图1 细菌与真菌产薯蓣皂苷酶活力的比较Fig.1 Hydrolysis of dioscin by enzyme produced by bacteria and fungi

由图1可知，2种真菌产薯蓣皂苷酶活力均比细菌高，其中Absidiasp.s00菌产薯蓣皂苷酶活力最高，苷元生成率最高，因此选择Absidiasp.s00菌作为薯蓣皂苷酶生产菌株。

2.2 薯蓣皂苷酶解反应条件的优化

2.2.1 最适底物质量浓度的选择

配制2、5、8、10、20、30、40、50g／L等不同质量浓度的薯蓣皂苷底物溶液，分别取0.1mL上述薯蓣皂苷底物溶液与0.1mL薯蓣皂苷酶液，40℃条件下反应30h，水饱和正丁醇终止反应，TLC检测酶活力，其结果经Band Scan分析如图2所示。

图2 底物质量浓度对酶活力影响Fig.2 Effect of substrate concentration on enzyme activity

由图2可知，底物质量浓度为2g／L时苷元生成率最高，当底物质量浓度增加到5g／L时苷元转化率急剧下降，当底物质量浓度大于5g／L时随着浓度的增加苷元生成率逐渐减小，从图2可看出在质量浓度为2～50g／L随底物质量浓度增加苷元生成率减小，由此可推测如果底物质量浓度小于2g／L苷元生成率可能会更高，但由于底物质量浓度太小在工业生产中过于耗费资源，即没有研究意义，故没有对更小浓度底物酶反应进行研究。选择2g／L为酶反应最适底物质量浓度。

2.2.2 最适反应时间的选择

在最适底物质量浓度的基础上，40℃条件下做13组微型酶反应，分别使酶反应进行3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36h后用水饱和正丁醇终止反应，通过TLC法检测酶活力，结果如图3所示。

图3 反应时间对酶活力的影响Fig.3 Effect of reaction time on enzyme activity

由图3可知，当反应时间小于30h时，苷元生成率随着反应时间的延长而增大；30h达到最大；当反应时间大于30h时，苷元生成率不变，因此，选择30h为最适酶反应时间。

2.2.3 最适反应温度的选择

配制最适底物浓度的薯蓣皂苷底物溶液，利用薯蓣皂苷与薯蓣皂苷酶液各0.1mL做7组微型酶反应，这7组酶反应分别在20、30、40、50、60、70、80℃等不同温度条件下进行30h后用水饱和正丁醇终止反应，经TLC检测酶活力，苷元生成率随反应温度变化如图4所示。

图4 反应温度对酶活力的影响Fig.4 Effect of reaction temperature on enzyme activity

由图4可知，反应温度对酶反应的影响很大，当反应温度小于40℃时，苷元生成率随着反应温度的升高而增大；当反应温度大于40℃时，苷元生成率随着反应温度的升高反而减小；在40℃时达到最大值，因此，选择40℃为最适酶反应温度。

2.2.4 最适pH值的选择

配制最适底物浓度的薯蓣皂苷底物溶液，取底物溶液0.1mL分别与等体积的pH值为4、5、6、7、8薯蓣皂苷酶在40℃条件下反应30h，水饱和正丁醇终止反应，通过TLC法检测酶活力，结果如图5所示。

图5 pH值对酶活力的影响Fig.5 Effect of pH on enzyme activity

由图5可见，pH为5时，苷元生成率最大；pH小于5时，苷元生成率随着pH值的增大而增大；pH大于5时，苷元生成率随着pH值的增大而减小，因此，选择5为最适酶反应pH值。

2.3 薯蓣皂苷的酶解

取100mL酶液与100mL质量浓度为10g／L的薯蓣皂苷在上述最适酶反应条件下，进行酶反应，反应结束后经TLC检测，结果如图6所示。

图6 酶反应产物的TLC图Fig.6 Enzyme reaction product in TLC

由图6可见，将酶解产物与薯蓣皂苷元标准品和薯蓣皂苷底物比较，黄姜薯蓣皂苷底物水解较好，薯蓣皂苷元生成率较高，经Band Scan分析得苷元生成率达80%，具有较高工业化价值。

2.3.1 石油醚萃取薯蓣皂苷元

为提纯薯蓣皂苷元，向反应产物水溶液中加入1／3体积石油醚，反复萃取3次，萃取结果如图7所示。由图7可知，经石油醚萃取后，苷元全部转移到石油醚层，萃取效果较好。将萃取后的苷元溶液浓缩，放在室温下使其自然结晶，抽滤，得苷元晶体。称得苷元质量为0.1g，苷元得率为10%。

图7 石油醚萃取结果Fig.7 Extract of diosgenin by petroleum ether on TLC

2.3.2 薯蓣皂苷元纯度检测

通过高效液相色谱检测苷元纯度结果见图8。由图8可知，保留时间为18.441min处为黄姜薯蓣皂苷元。根据图谱，黄姜薯蓣皂苷元的纯度为90%以上。

图8 薯蓣皂苷元的HPLC检测图谱Fig.8 The diosgenin on HPLC

3 结论

经比较，真菌Absidiasp.s00菌发酵产酶对薯蓣皂苷糖苷键具有较强的水解能力，能水解薯蓣皂苷成无糖基薯蓣皂苷元。利用TLC和Band Scan分析得出薯蓣皂苷酶反应最适底物质量浓度为2g／L，最适反应时间为30h，最适反应温度为40℃，最适pH 5.0。在最适反应条件下扩大酶反应，苷元转化率可达80%；经石油醚提纯，苷元得率为10%；高效液相色谱检测苷元纯度为90%以上。该方法适用于薯蓣皂苷元的大批量生成，具有良好的工业化前景。