养殖黑鲷迟缓爱德华菌的分离鉴定

闫茂仓 王雪鹏 丁 雷（浙江省海洋水产养殖研究所 温州 325005 山东农业大学动物科技学院）

迟缓爱德华菌是革兰氏阴性、能运动的短杆菌(直径1µm，长2～3µm)，可在NaCL浓度0～40g/L的培养基上生长，菌落直径0.5～1.0mm，菌落圆形，边缘整齐，灰白色，湿润。4～10℃能够生长，最适生长温度25～32℃，可在SS琼脂培养基上生长，菌落为黑色。这一种属的细菌主要是从人类的粪便、血液、伤口和尿中分离出来，因为这些细菌在生物学上与其他肠杆菌科成员不同，所以在1965年以美国细菌学家爱德华(1901～1966)的名字重新命名，为迟缓爱德华菌[1,2]。

迟缓爱德华菌由Hoshina在1962年首次从鳗鲡中分离到，感染范围很广，主要包括大菱鲆，牙鲆，鳗鱼，胭脂鱼，大马哈鱼，鳟鱼，鲤鱼，罗非鱼，鲶鱼和鳝鱼等，还可以感染两栖类、爬行类、鸟类、哺乳类等动物（包括人），是一种人畜共患病。不仅宿主种类不断增多，地域范围也不断扩展，除中国、日本、韩国、新加坡外，在美国、德国、意大利、南非、和挪威等都有相关病例报道[1,2]。

2009年夏季，浙江沿海某养殖场的黑鲷成鱼发生大规模死亡，作者从中分离了一株优势菌，经感染证实了该株菌是引起此次病害的病原菌，根据其形态学特性、培养特性、生化特性等，鉴定为迟缓爱德华菌，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 患出血病症状典型的濒死黑鲷。

1.1.2 培养基 2216E、TSB琼脂、LB培养基、 SS培养基，购自北京路桥技术有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 取患出血病症状典型的濒死黑鲷，用70%酒精棉球对病鱼体表消毒后，用无菌剪刀剪开腹腔并取出病鱼肝、肾、脾等组织小块于1ml无菌离心管中，在超净工作台上用无菌蒸馏水反复冲洗组织块，划线接种于2216E、TSB琼脂、LB培养基、 SS培养基，28℃培养24～48h，进行细菌形态特征观察。

1.2.2 细菌形态学观察 取纯培养物涂片，革兰氏染色，显微镜观察；同时送到电镜室做扫描电镜观察。

1.2.3 细菌生化试验 将菌种接种于TSA平板，28℃培养过夜。将细菌送至南京进出口检验检疫局用自动生化分析仪进行生化特性测定。

1.2.4 人工感染试验 感染用鱼210±10g，水温为23～27℃，试验容器为200L的水槽。先将分离菌接种在TSB固体培养基28℃培养36h,用灭菌的生理盐水洗下菌落，调整菌液浓度为1×108。10倍系列稀释共5个组，每组5尾，每尾腹腔注射100µl，对照组注射等量生理盐水，观察其感染后的发病与死亡情况，计算7d内的半数致死量。

2 结果

2.1 培养特征

从患病黑鲷分离到一株优势菌，此菌在2216E琼脂平板上生长缓慢，28℃恒温培养48h后形成白色细小菌落，直径小于0.5mm。在TSB和LB培养基上37 ℃生长36 h后形成圆形菌落，直径约0.5mm，微黄色，不透明；在TCBS平板上难以生长；在SS培养基上形成黑色菌落(见图1)。

图1 迟缓爱德华菌在SS培养基上生长的照片

2.2 形态特征

分离菌在显微镜和电镜下的照片见图2，革兰氏阴性，呈短杆状。

图2 迟缓爱德华菌革兰氏染色照片（A）和电镜照片（B）

表1 分离菌的生化试验结果

2.4 感染试验

在1周内，各感染组陆续出现死亡，对照组未出现症状，感染后的病鱼体表变黑，吻端发红，腹部鼓起有腹水，肛门红肿或突出体外。解剖后肝脏有的为白色斑点，脾脏肿大，肾脏暗黑色，易碎成糜状；肠黏膜充血，肿胀。经计算半数致死量为8.31×104cfu/mL，表明此菌有很强的致病性。

3 讨论

迟缓爱德华菌由日本学者于1962年在鳗鲡养殖场发病的鳗鱼中首次分离得到[3]。它可引起多种海、淡水鱼类的疾病，并且属于人畜共患的病原，因此对该菌的研究具有重要意义。本文从患病黑鲷体内分离出一株优势菌，经感染试验证明其为强毒株，在较低的剂量下也可引起黑鲷死亡。利用生化实验可准确鉴定为迟缓爱德华菌，可信度为99%。综合形态学特性、培养特性、生化特性、回归试验等可鉴定为迟缓爱德华菌感染。

近几十年来，我国对迟缓爱德华菌的研究较多，而有关迟缓爱德华菌感染黑鲷的研究比较少。最近有很多迟缓爱德华菌感染大菱鲆、牙鲆等鱼的报道[4]，且感染率和死亡率都很高，迟缓爱德华菌病应当引起足够的重视。

[1]Mohanty BR, Sahoo PK. Edwardsiellosis in fish: a brief review. J Biosci 2007;32(7):1331–1344.

[2]Xuepeng Wang, Chengping Lu. Mice orally vaccinated with Edwardsiella tarda ghosts are significantly protected against infection.Vaccine 2009, 27 :1571-1578.

[3]Hoshina T. On a new bacterium, Paracolobactrum anguillimortiferum.Bull Jpn Soc Sci Fish 1962,28(2):162–164.

[4]杨春志,王秀华,黄倢.养殖大菱鲆迟缓爱德华氏菌的分离鉴定与系统发育分析[J].上海水产大学学报,2008,17(3):280-284.