滑菇原生质体制备研究

陈 超,孟庆国,周建树,杨泽涛,赵 洁,韩 冰,李 杨,田 浩,王尚杰

(1.辽宁省微生物科学研究院,辽宁朝阳 122000;2.辽宁省葫芦岛市八家子经济开发区农业站,辽宁葫芦岛 125316)

滑菇原生质体制备研究

陈 超1,孟庆国1,周建树1,杨泽涛1,赵 洁1,韩 冰1,李 杨1,田 浩1,王尚杰2

(1.辽宁省微生物科学研究院,辽宁朝阳 122000;2.辽宁省葫芦岛市八家子经济开发区农业站,辽宁葫芦岛 125316)

通过对滑菇原生质体最佳制备条件的研究表明:利用OS培养基、1.5%溶壁酶将培养13 d的滑菇菌丝在0.6 mol/L甘露醇、pH 6.5、25℃条件下酶解5 h,原生质体产量最高,可达4.85×106个/mL。

滑菇;原生质体;制备

滑菇味道鲜美,营养丰富,表面附着的黏性物质是一种核酸,对保持人体的精力和脑力大有益处,同时还有抑制肿瘤的作用。我国1976年从日本引进滑菇栽培技术,目前以辽宁省和河北省栽培面积最大。号称“全国滑菇第一镇”的岫岩,全镇2万多名农民栽培滑菇。由于滑菇原生质体没有细胞壁,对诱变剂较敏感,是良好的诱变和融合对象,对食用菌育种具有重要意义。目前国内外有关食用菌原生质体制备和分离研究的报道较多,但关于滑菇的报道还较少。本文研究不同因素对滑菇原生质体分离效果的影响,摸索出滑菇原生质体制备的优化组合,并首次探讨了滑菇的不同生长期及不同部位(子实体、菌丝体和孢子)对滑菇原生质体产量的影响,为开展滑菇细胞工程育种和基因工程提供了参考数据[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 滑菇C3-1,本实验室保存。

1.1.2 培养基 ①PDA培养基:马铃薯汁200 g,葡萄糖20 g,水1000 mL;②OS培养基:洋葱提取物80 g,蔗糖50 g,酱油50 mL,水1000 mL;③GYP培养基:葡萄糖20 g,酵母粉1.5 g,蛋白胨1.5 g,水1000 mL;④混合培养基:滑菇子实体提取物200 g,马铃薯200 g,葡萄糖20 g,洋葱提取物80 g,硫酸镁0.5 g,磷酸二氢钾2 g,水1000 mL。

1.1.3 试剂 溶壁酶,广东省微生物研究所。

1.2 原生质体制备方法

1.2.1 酶液配制 称取适量溶壁酶溶于0.6 mol/L稳渗剂,0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。

1.2.2 菌丝培养 取直径5 mm的菌丝块接种于盛有100 mL液体培养基的250 mL三角瓶中,每瓶接种1块,25℃静置培养13 d。

1.2.3 原生质体制备与计数 将培养好的菌丝用相应稳渗剂洗涤3次,无菌滤纸吸取多余水分,每250 mg湿菌丝加1 mL酶液,在适当温度水浴酶解一定时间,双层擦镜纸过滤,置于离心管中, 1000 r/min离心10 min,弃去上清液,吸取1 mL酶解液,血球计数板计数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 渗透压稳定剂对原生质产量影响 脱去细胞壁的原生质体很脆弱,需要用特定渗透压稳定剂来保护,可维持原生质体内外环境渗透压的相对稳定,避免其吸水涨破,同时也能促进质壁分离和调节酶活。一般情况,无机盐及糖醇类都可作渗透稳定剂。本实验选择氯化钾、硫酸镁、蔗糖、甘露醇为渗透压稳定剂,浓度分别为0.3、0.6、0.9 mol/L,在pH 5.5、30℃、1.5%溶壁酶、OS培养基条件下酶解2 h,结果见表1。经极差分析,结果表明原生质制备和分离过程中,有机糖醇类原生质产量明显优于无机盐类,其中0.6 mol/L的甘露醇原生质产量4.35×106个/mL,效果最好。

2.1.2 实验结果分析 不同酶浓度、培养基、酶解时间、酶解温度、pH值、培养时间对原生质产量的影响,结果见表2。

表1 渗透压稳定剂对原生质产量影响(单位:个/mL)Table 1 The effect of stabilization on protoplast field

表2 不同酶浓度、培养基、酶解时间、酶解温度、pH值、培养时间对原生质产量影响Table 2 The effect of lywallzyme consistence、culture、disintegrate enzyme time、disintegrate enzyme temperature、pH、culture time effect on protoplast field

从表2看出,2.0%酶浓度原生质产量最大4.85×106个/mL,超过2.0%菌体脱壁太彻底,降低原生质再生能力。1.5%酶浓度和2%酶浓度原生质产量差异并不显著,综合考虑最佳酶浓度为1.5%;洋葱含有利于原生质体生长的物质,OS培养基原生质产量最高,达4.75× 106个/mL;酶解时间延长,原生质产量逐渐增加,5 h最大4.81×106个/mL。超过5 h,酶系统中过氧化物酶对原生质体损害强,原生质体活性降低,甚至造成原生质体破裂,导致产量降低[2];酶解温度升高,原生质体产量逐渐增加, 25℃最高4.75×106个/mL。超过25℃产量下降;酶解液pH值对滑菇原生质体分离也有明显的影响,但表现并不一致。原生质体释放呈低-高-低的趋势,其中pH值为6.5时的释放量最高,以下依次为6.0、5.5、5.0(7.0)、4.5、7.5。pH 5.5原生质产量最高4.65×106个/mL,小于或大于6.5时下降;菌丝培养13 d原生质产量最高4.75×106个/mL,并且多从菌丝侧面释放,体积较大,易于再生。菌龄不足13 d原生质体多从菌丝尖端释放,体积小、易破裂。

2.2 正交试验结果分析

根据单因素试验的结果,溶壁酶浓度为1.5%,培养基为OS培养基,培养菌龄13 d,选择原生质体制备率高的4个因素和3个水平进行L9(34)试验(见表3),采用极差分析法对结果进行分析(见表4)。

表3 滑菇原生质体制备因素与水平Table 3 Protoplast preparation factors and levels of Pholiota nameko

从表4可以看出,DB＞DD＞DA＞DC,说明酶解温度是影响原生质体制备率的最主要因素,其次是酶解时间及渗透压稳定剂的种类,pH对滑菇原生质体制备率影响最不明显。从试验结果中可以看出,B2D2C2A1是滑菇原生质体制备条件的最优组合。就酶解温度来说,由于K2＞K3＞K1,说明随着酶解温度的增长,原生质体制备率随之升高,25℃原生质体制备率已近高峰,若温度继续增长,原生质体制备率会有下降的趋势,这也与单因素试验的结果相符合。从酶解时间看,由于K2＞K3＞K1,这说明酶解5 h是原生质体制备率的高峰期,5 h时原生质体制备率开始出现下降的趋势,这也与单因素试验的结果相符。从渗透压稳定剂种类看,K1＞K3＞K2,说明渗透压稳定剂甘露醇浓度应为0.6 mol/L,从酶解液pH值看, K3＞K2＞K1,说明复合因子和单因子的实验结果有差别。

表4 L9(34)试验结果Table 4 L9(34)experiment results

综合试验分析结果,B2D2C2A1即酶解温度为25℃,酶解时间为5 h,渗透压稳定剂为0.6 mol/ L甘露醇,pH值6.5为滑菇原生质体制备条件的最优组合。

2.3 滑菇菌丝体、子实体、孢子原生质产量比较

滑菇的不同生长期及部位在1.5%溶壁酶、OS培养基、菌丝培养13 d、pH 6.5、0.6 mol/L甘露醇、25℃条件下酶解5 h,分别测得原生质的产量见表5。由表5可知,菌丝体原生质体的产量明显大于子实体和孢子,它们的排列顺序依次为菌丝体、子实体(菌盖、菌柄、基部)、孢子。

表5 滑菇不同生长期及部位的原生质产量比较Table 5 The experiment results about the different part and period of Pholiota nameko

3 讨 论

采用菌丝体为原材料,滑菇原生质体最佳制备条件:1.5%溶壁酶、OS培养基、菌丝培养13 d、pH 6.5、0.6 mol/L甘露醇、25℃条件下酶解5 h,原生质体产量达到4.85×106个/mL。通过滑菇原生质体制备研究,为滑菇育种工作打下了基础,但同时也存在如下问题需进一步研究。可尝试酶解前用疏基乙醇对滑菇菌丝预处理,打开细胞壁中硫键,使其对溶壁酶处理更敏感。因孢子生理状态比菌丝更易同步化,可尝试用效果更好的脱壁酶处理孢子以代替菌丝。因滑菇细胞壁结构复杂,各种脱壁酶活性不同,可用几种脱壁酶组合在一起,溶壁效果会更好。

[1]刘枢同,罗信昌.食用菌生物技术及应用[M].北京:清华大学出版社,1999:86-124.

[2]邱龙新.食用菌原生质体技术研究现状[J].龙岩师专学报,2002,20(6):49-51.

Protoplast Preparation of Huagu Mushroom(Pholiota nameko)

CHEN Chao1,MENG Qing-guo1,ZHOU Jian-shu1,YANG Ze-tao1, ZHAO Jie1,HAN Bing1,L I Yang1,TIAN Hao1,WANG Shang-jie2
(1.Liaoning Acad.of Microbiol.Sci.,Chaoyang122000;2.Agric. Sta.,Bajiazi,Eco.Devel.Zone,Huludao125316)

Study on the optimum conditions of preparation of Pholiota nameko(Pn)protoplast indicated that:using OS medium,put hyphae of Pn that had cultured for 13 days into the solution with 1.5%helicase,0.6 mol/L mannitol,pH 6.5,and digested for 5 hours in 25℃,the protoplast output could reach to the highest,and as high as 4.85 ×106/mL.

Pholiota nameko;protoplast;preparation

S646.1+6

B

1005-7021(2010)06-0089-04

陈超 男,研究实习员。主要从事食用菌研究工作。Tel:0421-2976895

2010-10-19;修回日期:2010-11-20