桂枝芍药知母汤对类风湿性关节炎滑膜细胞凋亡的基因调控的实验研究

余阗 卿茂盛 肖伟

类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性的炎症性关节病，其病理基础为关节滑膜炎，后期致滑膜增厚，骨与软骨组织受损。类风湿性关节炎(RA)的关节软骨和骨组织损害，与滑膜细胞的过度增生活化与凋亡不足密切相关[1]。研究表明，RA患者滑膜组织和成纤维样滑膜细胞中Fas／FasL减少或突变、细胞因子和Bcl-2表达增加、p53突变等，从而导致炎症细胞及滑膜细胞凋亡不足，表现为抑制凋亡和诱导凋亡免疫稳态失衡的病理改变[2]。

桂枝芍药知母汤始见于张仲景《金匮要略·中风历节病脉证并治第五》，历代医家均将其作为治疗痹证的主方在临床广泛应用。本研究试图探讨桂枝芍药知母汤对RA大鼠滑膜细胞增殖、凋亡的影响及对细胞凋亡调控基因的影响。

1 材料与方法

1.1 体内动物实验

1.1.1 动物造模与分组 选取清洁级Wistar大鼠30只，体重50～100g，用0.1mmol/L醋酸溶解Ⅱ型胶原蛋白(2mg/mL，4℃，过夜)，再与等量的弗氏完全佐剂混合，于冰浴中充分乳化，除正常组外，每只大鼠尾根部皮下多点注射胶原蛋白0.2mg。造模后10d将动物随机分为正常组、对照组和治疗组各10只。

1.1.2 桂枝芍药知母汤方药 桂枝，白芍，炙甘草，麻黄，知母，白术，炮附子，生姜。

1.1.3 实验方法

1.1.3.1 动物灌胃药物及取材 将桂枝芍药知母汤按常规方法煎煮浓缩成含生药1kg/L，4℃保存备用。造模后第10天治疗组大鼠灌服桂枝芍药知母汤制剂11g/(kg·d)，正常组灌服生理盐水，每日一次；对照组每6天予灌服一次MTX混悬液5mg/kg。连续饲养36d，均断头处死。取膝关节滑膜组织，一部分用福尔马林固定、包埋、切片，留待原位细胞凋亡检测；另一部分经Boin’s液固定1周后，组织脱水，常规石腊包埋、切片，留待细胞凋亡相关调控基因检测。

1.1.3.2 检测指标

①普通光镜观察 HE染色观察滑膜细胞凋亡的形态学观察。

②透射电镜观察 滑膜细胞凋亡的形态学观察。

③原位细胞凋亡检测(碱性磷酸酶标记法)。操作过程：a)脱腊(预加热60℃)到PBS溶液，划圈。b)0.1%柠檬酸钠Trition孵育8min。c)PBS漂洗2min×2次。d)加紫色瓶50μL标记混合物37℃孵育1h。e)PBS漂洗2min×2次。f)加黄盖瓶中50μL转换液37℃孵育30min。g)PBS漂洗3min×3次。h)加50μL显色液显色5～10min，PBS漂洗3次。g核快红复染核一两分钟，PBS漂洗，水溶性封片剂直接封片，60℃烘干。阴性对照：只加标记溶液代替核苷酸反应液。

检测细胞凋亡结果判定：在滑膜组织中，凋亡细胞呈深蓝或青紫色，每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中细胞的凋亡数，计数5～10个视野，标出每个视野平均细胞凋亡数。

④细胞化学检测细胞凋亡相关调控基因，SP法检测Fas抗原、Bcl-2蛋白、p53蛋白。操作过程：a)室温封闭20min，洗3次。b)将切片浸入0.01M枸椽酸缓冲液(pH6.0)、电炉加热至沸腾2min后，间隔5min，反复1次，冷却后PBS洗2次。c)滴加正常山羊血清封闭液，室温封闭30min。d)滴加1∶100(10mL+1mL PBS)兔抗人Fas、Bcl-2-抗、P53-抗，4℃过夜，PBS洗2min×3次。e)滴加链霉素卵白素(SABC)，室温下30min，PBS洗3次。f)DAB显色20min。g)常规脱水、透明、封片。

1.2 体外实验

1.2.1 建立RA动物模型 选取清洁级Wistar大鼠30只，体重50～100g，用0.1mmol/L醋酸溶解Ⅱ型胶原蛋白(2mg/mL，4℃过夜)，再与等量的弗氏完全佐剂混合，于冰浴中充分乳化，除正常组外，每只大鼠尾根部皮下多点注射胶原蛋白0.2mg。

1.2.2 动物分组、灌胃药物及取材 造模后第10天将动物随机分为正常组、对照组和治疗组各10只，将桂枝芍药知母汤按常规方法煎煮浓缩成含生药1kg/L，4℃保存备用。实验组灌服桂枝芍药知母汤制剂11g/(kg·d)，正常组、对照组灌服等量生理盐水，每日一次，连续饲养36d，断头处死，仰位固定。于膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出膝盖骨，继续向下分离，可见平滑光亮的滑膜组织，用手术刀分离关节的滑膜层和纤维层，然后取出滑膜层组织，每一只大鼠可采集双侧滑膜组织约15～20mg。将滑膜组织作连续切片和HE染色进行鉴定，不应含有软骨细胞和骨骼肌细胞。

1.2.3 滑膜细胞的分离和培养 无菌操作取大鼠膝关节滑膜组织，剪成1mm3大小后加入4ml0.4mg/mL的Ⅱ型胶原酶(溶于含10%胎牛血清的DMEM培养基)，于37℃、5%CO2条件下孵育3h，离心收集未贴壁的细胞，将细胞重悬于含有15%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、5%CO2条件下培养，用台盼蓝排斥试验检测基活力大于95%；分离的滑膜细胞经涂片和Giemsa染色，高倍镜下计数300个细胞，其纯度为95%以上。

1.2.4 药物血清的制备 将桂枝芍药知母汤按常规方法煎煮浓缩成含生药1kg/L，4℃保存备用。清洁级Wistar大鼠10只，分为两组，每组5只。实验组灌服桂枝芍药知母汤制剂11g/(kg·d)，对照组灌服等量生理盐水，连续灌药10d，于最后一次灌药后2h腹主动脉放血，无菌分离血清，以56℃、30min灭活处理后，0.45μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用。给药剂量：在体试验的给药剂量可按体表面积直接计算法换算动物和人之间的剂量。实际每次给药剂量=在体试验的给药剂量×反应系统中被稀释的倍数。

1.2.5 细胞分组并加入药物血清 将细胞分为3组：空白对照、空白血清和中药血清组。分别加入培养液、空白血清和中药血清后继续培养48h，然后进行效应指标检测。实验结果采用方差分析。

1.2.6 检测指标 ①扫描电镜，体外培养滑膜细胞经药物处理后的细胞形态学变化。②流式细胞仪，将培养的细胞悬液用酒精固定，PI染色后上机检测细胞凋亡情况。③DNA凝胶电泳，检测细胞凋亡。④细胞化学检测细胞凋亡相关调控基因，SP法检测Fas抗原、Bcl-2蛋白、p53蛋白。

2 结果

2.1 体内实验 见表1～3。

组织学改变①电镜观察:实验组可见细胞体变圆、胞浆量减少、胞核不规则及核染色质浓缩，胞膜完整，并可见凋亡小体等典型的凋亡形态改变。②流式细胞仪检测结果:凋亡细胞增加幅度实验组最明显，实验组与对照组及正常组增加幅度比较均有显著性差异(P＜0.05)。

2.2 体外实验 见表4～6。

组织学改变①电镜观察:可见细胞体变圆、胞浆量减少、胞核不规则及核染色质浓缩，胞膜完整，并可见凋亡小体等典型的凋亡形态改变。②流式细胞仪检测结果:加药后凋亡细胞增加幅度中药血清组最明显，中药血清组与空白对照组及空白血清组增加幅度比较均有显著性差异(P＜0.01)。③DNA凝胶电泳法检测结果:可见典型的细胞凋亡“梯状”电泳带。

3 讨论

桂枝芍药知母汤是《金匮要略》中的名方，具有祛风散寒除湿、温阳行痹和柔筋定痛等功效。本方温而不伤阴，如晨僵、关节肿痛、血沉、C反应蛋白等临床症状和实验室指标均有明显改善，有较好的消炎、镇痛及消肿等作用[3-5]。

表1 各组大鼠滑膜细胞凋亡和P53表达的结果±s)

表1 各组大鼠滑膜细胞凋亡和P53表达的结果±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05；与对照组比较，ΔP＜0.05。

组别 例数 凋亡细胞数/每视野 P53表达积分正常组 10 0.73±0.36 0.21±0.11对照组 10 3.25±0.97* 1.94±0.78*实验组 10 9.41±5.33*Δ 0.34±0.27Δ

表2 各组大鼠滑膜细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达的结果

表3 各组大鼠滑膜细胞凋亡和Fas表达的结果

Bcl-2是一个定位于核膜、部分内质网和线粒体外膜的癌蛋白，可保护细胞免于凋亡，并可特异的抑制P53介导的凋亡及生长抑制[6]；Fas是细胞表面的蛋白受体分子，分布于多种组织细胞，参与清除机体中被外来微生物感染的细胞和机体不再需要的细胞[7]；而P53是一种肿瘤抑制蛋白，可抑制细胞增殖和激活细胞凋亡，但突变型P53蛋白失去原有的抑癌功能，同时与野生型P53蛋白结合后可导致机体自身免疫反应，产生抗P53抗体[8]。

从本实验可得出，桂枝芍药知母汤浓缩液可明显减轻类风湿性关节炎大鼠滑膜增殖的病理改变，其作用是可能通过减弱大鼠滑膜细胞内Bcl-2表达，而提高Fas的表达，诱导滑膜细胞调亡，从而恢复细胞增生与凋亡的平衡。对照组P53蛋白的表达较正常组和治疗组增高，说明桂枝芍药知母汤治疗RA可能是通过抑制突变型p53的表达抑制滑膜细胞过度增生并诱导其调亡，从而发挥治疗作用。

表4 各组大鼠滑膜细胞凋亡和P53表达的结果(±s)

表4 各组大鼠滑膜细胞凋亡和P53表达的结果(±s)

注：与正常组比较，*P＜0.05；与对照组比较，ΔP＜0.05。

组别 凋亡细胞数/每视野 P53表达空白对照组 1.01±0.68 0.59±0.32空白血清组 4.51±1.12* 1.60±0.75中药血清组 10.56±4.96*Δ 0.60±0.89

表5 各组大鼠滑膜细胞凋亡和Bcl-2蛋白表达的结果

表6 各组大鼠滑膜细胞凋亡和Fas表达的结果

总之，通过桂枝芍药知母汤对大鼠类风湿性关节炎模型滑膜细胞凋亡基因调控体内、体外的实验研究，初步证明了桂枝芍药知母汤对RA滑膜细胞较强的诱导凋亡作用，为临床上治疗RA提供了实验和理论依据，同时桂枝芍药知母汤在诱导RA滑膜细胞凋亡的作用机制非常复杂，涉及体液、内分泌、免疫网络中的多种调节因子、多种转录、代谢调控因素，故还需从其他相关基因或蛋白表达方面做进一步研究。

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