一株耐高温无机磷降解菌解磷能力的研究

胡春明，姚 波，席北斗，魏自民，赵 越*，胡德胜

（1.东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030；2.中国环境科学研究院水环境系统工程研究室，北京 100012；3.北京师范大学环境学院，北京 100876；4.哈尔滨工程大学水声工程学院，哈尔滨 150001）

在农业种植方面，磷是植物必需的营养元素之一，大多数耕地土壤中磷素的95%与Fe、Ca和Al等结合成无效态磷，植物难以直接吸收利用，导致全国有74%的耕地土壤缺磷[1]。我国的农用磷肥主要是磷矿粉经加工而成[2]，但其中也有相当一部分为无效态磷，如直接施用，肥效受许多因素限制[3-4]。而解磷微生物可以通过活化难溶磷促进植物生长[5]。近年来的堆肥试验表明，在添加难溶性磷矿粉的堆肥中接种适合堆肥环境的耐高温解磷微生物，能够加快堆料中难溶性磷的转化，获得富磷生物有机肥[6-7]。因此，为提高堆肥中难溶性无机磷的转化效率，筛选、驯化适合于堆肥环境的高温无机磷降解微生物逐渐引起研究者的重视[8-9]。随着对解磷微生物研究的深入，有较多的解磷菌被报道，但大多是一些常温菌，不适合于堆肥复杂的高温环境。本研究采用课题组从高温堆肥样品中筛选得到的1株耐高温无机磷降解菌株，结合不同因素水平的正交试验设计，阐明各因素水平对其解磷能力的影响，进而为其在实际堆肥中的应用与推广奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

高温无机磷降解菌：霉菌，由东北农业大学生命科学学院微生物学实验室提供。耐受温度范围广（35～50℃），解磷能力强。

1.1.2 磷矿粉

磷矿粉：总磷16.56%；速效磷（柠檬酸-P）3.55%；水溶性磷0.25%，取自贵州某磷矿厂。

1.1.3 培养基

1.1.3.1 无机磷固体培养基

用于对菌种活化，难溶性磷矿粉为其中唯一磷源。葡萄糖 10 g，（NH4）2SO40.5 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，磷矿粉5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，琼脂粉 18 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3.2 种子培养基

葡萄糖 10 g ，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，KH2PO45 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.1.3.3 发酵培养基

葡萄糖 10 g ，（NH4）2SO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，磷矿粉添加量见表1，分别按4、5、6、7 g·L-1的水平数进行，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

本试验采用正交设计软件（正交设计助手ⅡV3.1），将发酵温度、培养时间、磷矿粉添加量及菌剂接种量作为优化因素，选定L16（45）正交表，并安排一个空列填充因素数。

1.2.2 菌株的活化

将供试菌株用无机磷固体培养基进行斜面划线，按表1中相应的温度水平在培养箱里培养，活化菌种。

表1 正交设计因素及水平Table1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.3 种子液制备

将1.2.2中活化好斜面保藏的解磷菌株，接种于种子培养基中，解磷菌按表1中相应的温度水平，120 r·min-1，摇床培养 72 h，菌种量 108cfu·mL-1，备用。

1.2.4 发酵培养处理

将种子液按表1中的接种量水平接种至发酵培养基中，120 r·min-1条件下摇床培养，培养时间和温度均按照表1中的水平进行，并以接灭活菌为对照组，对可溶性磷及微生物量磷等相关指标进行分析测定，同时制作相应的磷标准曲线。

1.2.5 解磷量的测定

可溶性磷的测定：将发酵培养基于5 000 r·min-1离心10 min，取上清夜，钼锑钪比色法测定可溶性磷含量[10]。

微生物量磷的测定：将上述离心后所得的菌种，用无菌水反复冲洗、离心，洗去菌种表面粘附的发酵液，121℃灭活30 min，加6%的H2O25 mL，60℃水浴48 h以破坏菌体，释放出微生物量磷，离心取上清液，钒钼黄比色法测定微生物量磷[10]。根据如下公式计算解磷总量和无机磷降解率。

解磷总量（μg·mL-1）=可溶性磷量+微生物量磷

微生物解磷率（%）=[（接菌的发酵培养基中解磷总量-接灭活菌的发酵培养基的对照组中的解磷总量）/添加的磷矿粉中的总磷量]×100%

2 结果与分析

2.1 解磷总量的变化

2.1.1 解磷总量的直观分析

结果见表2。当发酵液中磷矿粉添加量为7.0 g·L-1、高温无机磷降解菌的接种量5 mL·L-1时，在45℃下培养22 d后，发酵液中解磷总量达到最大327.60 μg·mL-1。由于该组数据中磷矿粉的添加量为最大比例，而菌剂接种量则为最小比例，说明在本研究的接种范围内，解磷量与解无机磷微生物的接种量没有明显的相关性。同时，在16组试验数据之中，培养时间为22 d的条件下，其解磷总量都相对较大。

由表2可知，时间的极差值为156.607，对发酵液中解磷总量的影响最大，在磷成为微生物生长繁殖的限制因素时，培养时间的增加，微生物的解磷时间增加，结果也使得发酵液中总磷含量增加。温度的极差值最小（10.167），这是由于该菌株的耐热性范围较广，在35～50℃温度范围均具有较高的活性。发酵液中磷矿粉添加量的极差值也相对较小，这说明选择4、5、6、7 g·L-1这个范围的量添加磷矿粉，对解磷微生物的解磷能力影响不大。研究表明，在磷矿粉添加量达到15 g·L-1的情况下，会严重影响解磷菌的解磷环境，使得解磷能力严重降低。

表2 解磷总量的正交设计软件分析Table2 Analysis of total soluble phosphorus by orthogonal design software

2.1.2 解磷总量的方差分析

图1为经正交设计软件分析出的F值，培养温度的方差最小（0.019），主要是因为该菌的温度耐受范围较广，在试验设计的温度范围内（35～50℃）均具有很好的解磷能力；图1中仅时间的F值（4.534）大于临界值3.29，这与极差分析中时间对解磷量的影响最大相一致，同时说明该株菌的解磷总量在本研究限定的较窄的范围内与温度、添加磷矿粉的量及接种量等因素相关性不显著。

2.2 微生物解磷率变化

2.2.1 微生物解磷率的直观分析

本试验供试菌株，在培养基中磷矿粉添加量、菌剂接种量分别为4 g·L-1和11 mL·L-1，50℃下培养22 d后，微生物的解磷率最大（37.55%），该组试验中菌剂接种量最大。其次是培养条件为：磷矿粉添加量4 g·L-1，在接种9 mL·L-1的解磷菌后，于45℃下培养17 d后，无机磷的降解率达34.47%，解磷率也比较高。

正交软件对微生物解磷率的分析结果见表3。时间对发酵液中微生物解磷率的影响最大，极差达17.412，这与发酵液中解磷总量分析相一致，培养时间的增加，使得解磷微生物对磷矿粉中的无机磷转化时间增加，最终增加了解磷率。发酵液中菌剂接种量的极差最小（1.855），这是因为发酵过程中，解磷微生物能够利用环境条件和自身的解磷能力迅速繁殖，说明菌剂接种量不是无机磷降解的限制因素。

表3 微生物解磷率的正交设计软件分析Table3 Analysis of inorganic phosphorus-solubilizing ratio by orthogonal design software

2.2.2 磷矿粉降解率的方差分析

如图2所示，时间的F值（3.55）大于临界值3.29，说明发酵液培养时间与微生物的解磷率呈显著相关性，这与极差分析中时间对解磷总量的影响最大相一致；因素中添加磷矿粉的量、温度及接种量的F值均小于F临界值，相关性不显著，说明这些因素在本研究限定的范围内不是该菌株解磷量和解磷率的主要限制因素。

3 讨论与结论

由于在堆肥的过程中，温度变化范围较广，分别经过升温、高温及降温等过程。在堆肥周期内，堆料的温度一般均保持30℃以上，因此，接种微生物在不同温度水平下是否具有活性是其在堆肥中成功应用的关键因素。本试验研究结果证实，在温度为45℃培养条件下，培养时间22 d、磷矿粉添加量 7.0 g·L-1、菌剂接种量为 5 mL·L-1，发酵液中解磷总量达到最大值（327.60 μg·mL-1）。不同因素水平条件下，温度水平对试验选取的解无机磷菌的解磷量及解磷率极差均较小，在培养温度35～50℃条件下，解无机磷微生物均具有较高的解磷能力。本研究解无机磷微生物对温度的耐受范围分析结果也为其在堆肥中应用提供了依据，在实际接种堆肥过程中，除堆肥高温期（>50℃）外，试验采用的解无机磷菌株能够适应堆肥过程中温度变化，而堆肥的高温期可以通过解无机磷微生物接种时间的控制加以避开，进而充分保持接种微生物的解磷活性。本试验研究结果证实，培养时间是解无机磷微生物解磷量及解磷率的主要限制因素，说明随着培养时间的延长，该解磷微生物可能通过自身的繁殖保持群落的稳定性，进而持续增加其对难溶性磷矿粉的解磷量及解磷率，培养时间22 d后难溶性磷矿粉的解磷量及解磷率可能会持续增加。但是，在一般情况下，采用反应器堆肥周期大都低于20 d，因此本试验对于22 d后难溶性磷矿粉的解磷量及解磷率未作进一步的研究。

[1]赵小蓉,林启美.微生物解磷的研究进展[J].土壤肥料,2001,5(3):7-11.

[2]魏自民,席北斗,王世平,等.垃圾堆肥对难溶性磷转化及土壤磷素吸附特性影响[J].农业工程学报,2006,22(2):142-146.

[3]钟传青,黄为一.提高磷矿粉肥效的生物学途径[J].化肥工业,2002,29(2):15-17.

[4]钟传青,黄为一.磷细菌P17对不同来源磷矿粉的溶磷作用及机制[J].土壤学报,2004,41(6):931-937.

[5]林启美,王华,赵蓉,等.一些细菌和真菌的解磷能力及其机理初探[J].微生物学通报,2001,28(2):26-30.

[6]魏自民,席北斗,赵越,等.城市生活垃圾外源微生物堆肥对有机酸变化及堆肥腐熟度的影响[J].环境科学,2006,27(2):376-380.

[7]魏自民,王世平,席北斗,等.生活垃圾堆肥对难溶性磷有效性的影响[J].环境科学,2007,28(3):679-683.

[8]李鸣晓,席北斗,魏自民,等.耐高温解磷茵的筛选及解磷能力研究[J].环境科学研究,2008,21(3):165-169.

[9]魏自民,席北斗,赵越,等.高温解磷菌对堆肥中所添加难溶性磷矿粉转化试验研究[J].环境科学,2008,29(7):2073-2076.

[10]鲁如坤.土壤农业化学分析方法[M].北京:中国农业科技出版社,2000:433-435.