酪素季铵盐衍生物的合成、表征与抗菌性能

李慧灵,雷万学,2,林 钰,张廷有

(1.河南教育学院化学系,河南郑州 450001;2.四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室,四川成都 610065)

酪素季铵盐衍生物的合成、表征与抗菌性能

李慧灵1,雷万学1,2,林 钰1,张廷有2＊

(1.河南教育学院化学系,河南郑州 450001;2.四川大学皮革化学与工程教育部重点实验室,四川成都 610065)

以硝酸铈铵为引发剂,以甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵为活性单体,与酪素进行接枝共聚反应制备季铵盐型酪素衍生物.用核磁共振、红外光谱、热重分析仪与激光粒度 Zeta电位仪对接枝产物进行了表征和测定,用悬菌定量杀菌试验研究了其抗菌性能.结果表明:甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵季铵盐单体通过其双键接枝到酪素表面;酪素的零电位 pH=4.6,而酪素季铵盐衍生物的零电位 pH=10.4,由于阳离子季铵基团的引入使酪素的零电位发生了较大的位移;所制备的酪素季铵盐衍生物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌与白色念珠菌在振荡作用 15 min后,平均杀菌率分别为 99.99%、99.99%和 92.33%.

酪素;季铵盐;接枝共聚;1H NMR;FTIR;抗菌

0 前言

酪素 (casein)又称酪蛋白、干酪素、乳酪素等,主要是从牛乳中分离、提取出的一种纯天然、含磷的复合蛋白质,为白色、无味、无嗅的细小颗粒或粉末.它是由一类在构造和性质上相类似的蛋白质 (如:αs1-酪蛋白,αs2-酪蛋白,β-酪蛋白,κ-酪蛋白)组成[1].其化学组成大致为 C170H268N42SPO51,其平均相对分子质量因制备方法不同而存在较大差异,一般为 75 000～350 000,等电点约为 4.6[2].酪素溶于稀碱和浓酸,在稀酸中沉淀,几乎不溶于水,但在水中溶胀,溶胀后的酪素更容易溶于酸、碱溶液.酪素的分子结构基本上与普通蛋白质结构相似,是高分子的氨基酸缩合物,以肽键(—NH—CO—)互相连接而成,而侧链中含有大量的羧基(—COOH)、氨基(—NH2)及羟基(—OH)等活性官能团,在引发剂存在的条件下,就可以引入某些单体对酪素进行改性[3].由于酪素具有可食性与成膜性等多种特性,同时具有生物亲和性与可降解性较好、不产生二次污染、价廉易得等特点,而且酪素中含有多种反应性基团容易制备成各种衍生物[4-6],使其在食品、生物、医药、化工等领域中具有很好的应用前景[7].研究酪素与季铵盐的接枝共聚反应,给天然高分子表面接枝抗菌基团,合成酪素季铵盐衍生物高分子抗菌材料,为进一步扩大酪素的应用领域开辟了新的途径.作者研究了酪素与甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵的接枝反应,得到季铵盐型酪素衍生物,用核磁共振、红外光谱、热重分析仪和激光粒度 Zeta电位仪对其进行了表征和测定,并用悬菌定量杀菌试验对其抗菌性能进行了测试.有关酪素与甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵的接枝共聚反应及其生物学活性尚未见文献报道.

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1-溴代正十八烷 (ODB):成都市科龙化工试剂厂;甲基丙烯酸 -2-(N,N二甲基氨基)乙酯(DMAM):山东淄博化工有限公司;酪素:成都市科龙化工试剂厂;硝酸铈铵、对苯二酚、丙酮、无水乙醚、Tween-80、卵磷脂等试剂均为分析纯.

1.2 仪器及设备

Bruker AVⅡ 600MHz核磁共振波谱仪: Switzerland;Nicolet FTIR红外光谱仪:USA;Netzsh热重分析仪(TG):Germany;Malvern激光粒度 Zeta电位仪:England;DHP—9082恒温培养箱:上海益恒实验仪器有限公司;S W—CJ—2FD无菌工作台:苏州净化设备有限公司.

1.3 菌种

白色念珠菌 Candida albicans(ATCC 10231)、金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus(ATCC 6538)、大肠杆菌 Escherichia coli(8099):河南省防疫站赠.伊红美蓝固体培养基:青岛海博生物技术有限公司;营养琼脂培养基与LB培养基(液体及固体)均为自配.

1.4 制备方法

1.4.1 甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵的合成(DMAM-ODB)

参照文献[8]所述方法,将等摩尔的 1-溴代正十八烷与甲基丙烯酸 -2-(N,N二甲基氨基)乙酯加入三口烧瓶中,并加入适量的丙酮作为溶剂,再加入少量的对苯二酚作阻聚剂,充分搅拌,加热至 40℃,反应 20 h.冷却,抽滤,将产物结晶用无水乙醚洗涤,然后用无水乙酸乙酯重结晶,最后于室温真空干燥,得到纯净的甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵的白色针状晶体.

1.4.2 酪素季铵盐衍生物的合成 (Cas-g-DMAMODB)

参照文献[9]所述方法,在三口烧瓶中加入 5 g酪素和 100 mL蒸馏水,在搅拌下充分溶胀,调节溶液 pH=3.0,使酪素完全溶解,通入N2,加热至 55℃,30 min后,分别滴加 0.001 mol/L硝酸铈铵的硝酸溶液与 0.010 mol的甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵水溶液,恒温反应4 h.冷却,反应混合液用体积分数为 50%的乙醇溶液进行沉淀,过滤,洗涤,室温真空干燥,然后将其以三氯甲烷为萃取剂用索氏萃取器萃取 24 h,去除季铵盐均聚物,最后将产物在室温下真空干燥,即得到纯净的酪素季铵盐衍生物.

1.5 测试与表征

采用核磁共振波谱仪、FTIR红外光谱仪、热重分析仪(TG)和激光粒度 Zeta电位仪分别对接枝产物进行核磁、红外与热重分析测试及其分散系的 Zeta电位测定.

1.6 抗菌试验

1.6.1 DMAM-ODB的最小抑菌浓度的测定

最小抑菌浓度 (minimal inhibited concentration,M IC)是指抗菌剂抑制微生物生长的最低浓度.本试验采用营养肉汤稀释法测定DMAM-ODB的最小抑菌浓度,试验微生物为大肠杆菌(8099).试验过程:将浓度为 25 g/L的 DMAMODB溶液用蒸馏水做对倍系列稀释制成不同浓度的溶液,取各稀释度的溶液 2.5 mL加入到含2.5 mL双倍浓度营养肉汤的试管中.取 0.1 mL含菌量约为 108cfu/mL菌悬液接种于含DMAMODB的营养肉汤的试管中,作为试验组样本,以同样方法接种不含DMAM-ODB的营养肉汤的试管中,作为阳性对照组样本,取 2支含营养肉汤的试管,作为阴性对照组样本.将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置 37℃培养箱中,培养 48 h,观察结果.

1.6.2 悬菌定量杀菌试验

选用 3种致病性微生物白色念珠菌(ATCC10231)、金黄色葡萄球菌 (ATCC6538)和大肠杆菌 (8099),分别作为真菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表,按照文献 [10]所述方法,进行悬液定量抗菌实验.在 3个 250 mL锥形瓶中分别加入 0.5 g所合成的酪素季铵盐衍生物抗菌材料(对照样不加抗菌材料),然后各加入 90 mL无菌水及 10 mL 108cfu/mL的菌悬液,固定在水浴振荡器中(20℃,300 r/min),分别振荡至规定时间后加入中和剂,继续振荡 10 min,取 0.5 mL,10倍梯度稀释后作活菌计数,于 37℃培养48 h,统计菌落数并计算杀菌率.

2 结果与讨论

2.1 甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵1H NM R分析

在常温下,甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵的1H NMR波谱如图 1所示.

通过分析图 1中各峰的化学位移及积分面积,结合甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵分子中各种氢原子所处的化学环境,确定了各峰的归属,这表明 1-溴代正十八烷与甲基丙烯酸 -2-(N,N二甲基氨基)乙酯发生了季铵化反应,生成了甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵[11].

通过比较图 2中 a与 b的红外光谱可见:反应产物Cas-g-DMAM-ODB除了保留酪素的特征吸收峰外,在 1 725 cm-1处有一个较强的吸收峰,说明反应产物中含有羰基;在 1 386 cm-1处出现的强吸收峰为 CH3的δs,C-H特征吸收峰;在 2 923 cm-1、2 853 cm-1和 1 467 cm-1处出现的吸收峰,分别为 CH2的υa,C-H、υs,C-H和δC-H吸收峰,说明反应产物结构中含有 CH2;在 721 cm-1处出现的吸收峰为 CH2的ρC-H吸收峰,说明反应产物中至少有 4个 CH2相连接.这表明甲基丙烯酰氧乙基-十八烷基 -二甲基溴化铵与酪素发生了接枝共聚反应生成了酪素季铵盐衍生物[11].

2.3 酪素及其季铵盐衍生物的 TG分析

用热重分析仪 (TG)分别测得酪素和酪素季铵盐衍生物的峰温变化,结果见表 1.

表1 酪素和Cas-g-DMAM-ODB的峰温 ℃

由表 1可知,酪素在 320.7℃存在一个失重峰,这是由于酪素在该温度下受热分解速率最大.而接枝产物 Cas-g-DMAM-ODB除了在该温度附近(318.9℃)出现一个相似的失重峰外,还在280.4℃和 406.6℃各有一个失重峰,这是由于酪素接枝季铵盐后,分子侧链发生改变的缘故.

2.4 酪素及其季铵盐衍生物的 Zeta电位分析

酪素及其季铵盐衍生物的 Zeta电位见图 3.

图3 酪素和Cas-g-DMAM-ODB的Zeta电位

由图 3可以看出:酪素的零电位 pH=4.6,当溶液的 pH＜4.6时,酪素的表面带正电荷;当溶液的 pH＞4.6时,酪素的表面带负电荷.因此,酪素在水介质中通常带负电荷,并且随溶液的 pH值增大,其负电荷增多.而酪素季铵盐衍生物的零电位 pH=10.4,故其在水介质中通常带正电荷,这是由于其表面接枝了季铵盐阳离子基团的缘故,而且其表面所带的电荷的变化规律与酪素相似[11].

2.5 DMAM-ODB的最小抑菌浓度

对试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本进行观察,结果为:阳性对照管有细菌生长(混浊),阴性对照管无菌生长 (透明),试验组无菌生长的最高稀释度所对应的DMAM-ODB浓度为 0.390 6 g/L,故DMAM-ODB的最小抑菌浓度为 0.390 6 g/L.

2.6 酪素季铵盐衍生物的抗菌效果分析

悬菌定量杀菌试验表明,酪素季铵盐衍生物Cas-g-DMAM-ODB与白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作用不同的时间,其杀菌效果不同,结果见表 2.

表2 Cas-g-DMAM-ODB与试验微生物作用不同时间的杀菌效果

从表 2可以看出:随着酪素季铵盐衍生物与试验微生物的作用时间的增加,其杀菌率也相应的提高,与作用时间呈正相关.当酪素季铵盐衍生物分别与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌作用 15 min时,其杀菌率分别达 99.99%、99.99%和 92.33%,这说明酪素季铵盐衍生物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有很强的灭杀作用,而对白色念珠菌的灭杀作用弱一些.

高分子季铵盐抗菌材料的灭菌机理目前尚不十分清楚,但一般认为,高分子化后的季铵盐型抗菌材料,由于其相对分子质量增大,季铵基团所带正电荷密度提高,更容易将细胞表面带负电荷的微生物吸附至其表面,破坏微生物的细胞膜,并导致其细胞膜破裂而死亡.其灭菌过程由吸附和杀灭两步构成,前者为快速过程,而后者则是慢速过程[12].

用季铵盐与酪素进行接枝共聚所制备的酪素季铵盐衍生物,属于高分子化的季铵盐型抗菌材料,其灭菌机理也应该服从上述步骤,作者合成的酪素季铵盐衍生物 Cas-g-DMAM-ODB的零电位pH=10.4,在水溶液中通常带正电荷,因此有较强的杀菌作用.

3 结论

以硝酸铈铵为引发剂,利用甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵上的双键,与酪素进行接枝共聚反应可以合成季铵盐型酪素衍生物抗菌材料.

酪素及其季铵盐衍生物的红外光谱和 TG分析结果表明:甲基丙烯酰氧乙基 -十八烷基 -二甲基溴化铵已经接枝到酪素上;酪素的零电位 pH =4.6,酪素季铵盐衍生物的零电位 pH=10.4,由于阳离子季铵基团的引入使其零电位向 pH值增大的方向发生了很大的位移.

悬菌定量杀菌试验方法测定酪素季铵盐衍生物抗菌材料对 3种致病性微生物革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌 (ATCC6538)、革兰氏阴性菌——大肠杆菌 (8099)以及真菌——白色念珠菌 (ATCC10231)的 15 min杀菌率分别为99.99%、99.99%、92.33%.酪素季铵盐衍生物抗菌材料对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都有很强的灭杀效果,对真菌的灭杀效果弱一些.

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SYNTHESIS,CHARACTER IZATION AND ANTIBACTER IAL PROPERTY OF QUATERNARY AMMON IUM SALTDER IVATIVES OF CASEIN

L IHui-ling1,LEIWan-xue1,2,L IN Yu1,ZHANG Ting-you2
(1.Departm ent of Chem istry,Henan Institute of Education,Zhengzhou450001,China; 2.The Key Laboratory of Leather Chem istry and Engineering of M inistry of Education, Sichuan University,Chengdu610065,China)

The quaternary ammonium salt derivatives of casein were prepared by graft copolymerization of methacryloxylethyl-octadecyl-dimethyl ammonium bromide monomer and casein in the presence of ceric ammonium nitrate as the initiator.The graftproductwas characterized and deter mined by hydrogen nuclearmagnetic resonance spectroscopy(1H NMR),Fourier transform infrared spectroscopy(FTI R),thermogravimetric analyzer(TGA),and laserparticle size and zeta potential analyzer,and the antibacterialpropertiesof the product were tested by the suspension quantitative test.The results show that methacryloxylethyl-octadecyl-dimethyl ammonium bromide monomer is grafted onto the surface of casein through double bonds;the zero potential pH value of casein is equal to 4.6,and the zero potential pH value of quaternary ammonium salt derivativesof casein is equal to 10.4.Accordingly,the zero potential of casein has large shift after the introduction of cationic quaternary ammonium group.The produced quaternary ammonium salt derivativesof casein had high effects in inhibitingE.coil(8099),S.aureus(ATCC 6538)andC.albicans(ATCC10231)after shaking for 15 min, and the average sterilization rateswere 99.99%,99.99%and 92.33%,respectively.

casein;quaternary ammonium salt;graft copolymerization;1H NMR;FTIR;antibacterial

TS201.2

B

1673-2383(2010)03-0054-05

2010-03-16

教育部博士点基金资助项目 (20050610047);河南省自然科学基金资助项目(0611020600)

李慧灵(1967-),女,河南驻马店人,副教授,硕士,研究方向为天然产物和精细化工产品结构与性能.

＊通信作者