羊骨木瓜蛋白酶水解物对小鼠免疫功能的影响

霍乃蕊，岳文斌，刘玉花，马俪珍，孔保华

(1.山西农业大学，太谷030801;2.东北农业大学，哈尔滨150030;3.天津农学院食品系，天津 300384)

羊骨木瓜蛋白酶水解物对小鼠免疫功能的影响

霍乃蕊1，岳文斌1，刘玉花2，马俪珍3，孔保华2

(1.山西农业大学，太谷030801;2.东北农业大学，哈尔滨150030;3.天津农学院食品系，天津 300384)

目的 探讨不同剂量的羊骨木瓜蛋白酶水解物对健康小鼠免疫功能的影响。方法 按体质量将ICR 小鼠分成对照组(0 g/(kg·bw))及低(0.5 g/(kg·bw))、中(1.0 g/(kg·bw))、高(3.0 g/(kg·bw))3 个剂量组，分别以碳粒廓清试验和溶血试验评价水解物对非特异性免疫和体液免疫的影响;以噻唑蓝分光光度法评价低(0.01 mg/mL)、中(0.1 mg/mL)、高(1 mg/mL)不同浓度水解物对细胞免疫功能的影响。结果 只有中剂量水解物才能显著提高吞噬细胞的吞噬能力;3个剂量组小鼠脾细胞的抗体生成量均显著高于对照组，但高剂量组显著低于中、低剂量组;3个浓度的酶解物均能促进体外ConA诱导的T淋巴细胞增殖活性，但高浓度的促分化效果不如低浓度和中浓度。结论 羊骨木瓜蛋白酶水解物能增强小鼠的特异性和非特异性免疫功能，但这种免疫促进作用与剂量并不呈线性关系。

羊骨;木瓜蛋白酶水解物;ICR小鼠;免疫功能

免疫活性肽是继中草药、多糖、植物提取物、维生素［1－5］、矿物质等后被发现的新型免疫增强剂，其来源广泛，又可利用现代生物技术特别是酶工程技术和发酵工程技术进行大规模生产。

我国为畜产大国，畜骨的利用率极低，目前多用于动物饲料。占骨骼蛋白90%的胶原蛋白，经酶水解可生成胶原多肽和氨基酸。不同酶解工艺制备的胶原多肽，其消化吸收率可达100%，并且具有抑制血压上升、预防骨质疏松、抑菌及促进皮肤胶原代谢等功能。研究表明酶法水解酪蛋白、大豆、玉米胚芽、牛乳蛋白、鸡蛋清、面筋蛋白等所得的水解物中都含有免疫调节肽，可增强正常动物或免疫力低下动物的免疫功能［6－9］。关于羊骨胶原肽对机体免疫力的调节作用还未见报道，本研究对羊骨胶原木瓜蛋白酶水解物对小鼠的非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫的影响进行评价并探讨量效关系，进而为保健食品开发和实现畜骨的深度开发利用提供理论依据。

1 材料方法

1.1 实验材料

新鲜羊骨(天津中敖食品集团公司)、木瓜蛋白酶 (60 000 U/g，天津市诺奥酶制剂公司)、RPMI－1640不完全培养液(Gibco)、胎牛血清(中国医学科学院生物工程研究所)、噻唑蓝(MTT)、ConA(Sigma公司)等。

1.2 实验动物

清洁级ICR小鼠，体质量18～22 g，购自中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心【SCXK(津)2005－0001】。在光线暗的安静环境中塑料饲养箱内饲养，环境温度为(24±2)℃，相对湿度40% ～60%，自由采食和饮水。饲料为天津市华荣实验动物科技有限公司提供的基础饲料。豚鼠，体质量300～400 g，购自天津实验动物中心【SYXK(津)2008－0005】。实验过程中遵循实验动物使用的3R原则并给予小鼠和豚鼠人道主义关怀。

1.3 样品制备

通过正交试验，以酶解物对T淋巴细胞的促转化能力为筛选指标，确定了最佳酶解条件:羊骨骨粉的底物浓度为0.271 kg/L，木瓜蛋白酶添加量为1576 U/g，64.05℃酶解7.22 h，反应结束后沸水浴灭酶5 min，3500 r/min离心10 min，上清液冷冻干燥成粉末。

1.4 非特异性免疫试验(碳粒廓清试验)

32只ICR健康小鼠按体质量随机分为4组:对照组以及低、中、高3个剂量组。干物质溶于生理盐水中，每天定时等体积灌胃1次，灌胃的干物质分别为 0、0.5、1、3 g/(kg·bw)，连续灌胃 14 d。末次灌胃24 h后，按0.01 mL/g体重尾静脉注射用生理盐水4倍稀释的印度墨汁，在第2 min、第10 min从内眦静脉丛采血20 μL，加入到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，摇匀。以0.1%Na2CO3溶液作空白对照，测A600值。将小鼠处死，取肝、脾，称质量。校正吞噬指数a的计算公式如下，式中K表示吞噬速率，t为不同采血时间。

1.5 体液免疫试验(溶血分光光度法)

豚鼠心脏采血，离心分离血清，置－20℃保存，临用前以生理盐水作1∶10稀释。小鼠分组方法与灌喂剂量同1.4，连续30 d，第25天，用2%SRBC腹腔免疫小鼠，实验结束时，无菌操作摘取小鼠脾，剪碎，挤压研磨，过200目筛，用PBS冲洗细胞，2000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL的红细胞裂解液，静置10 min，离心，再加入 PBS洗涤离心，最后加入2 mL的PBS悬浮。台盼蓝染色法进行细胞计数，使细胞浓度达到每毫升5×106个。取0.5 mL细胞悬液，加入0.2%SRBC和10%豚鼠血清各1 mL，混匀，对照管不加脾细胞悬液，以 PBS补充。37℃保温1 h后，2500 r/min离心10 min，取上清液于430 nm处测光吸收值。

1.6 细胞免疫试验(MTT比色分析法［3］)

将酶解物配置成1、0.1和0.01 mg/mL 3个浓度，MTT法测定其对小鼠脾 T淋巴细胞增殖(经ConA诱导)的影响。小鼠脾细胞悬液经RPMI 1640不完全培养液洗涤3次后，细胞计数并用 RPMI 1640完全培养液(含10%小牛血清)稀释至5×106cells/mL。在96孔酶标板中，每孔加入100 μL细胞悬浮液。阴性对照孔中再加入20 μL的完全培养液;阳性对照孔中分别加入10 μL完全培养液和10 μL ConA;试验孔中加入 10 μL ConA 和 10 μL 酶解液。在5%CO2培养箱中37℃培养72 h。培养结束前 6 h，每孔加入 10 μL MTT(5 mg/mL)，培养结束后，每孔加100 μL 10%的 SDS终止反应，37℃过夜，490 nm波长下测各孔的A值。免疫调节活性以刺激指数(stimulation index，SI)来表示。SI=样品A值/阳性对照A值。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 对小鼠吞噬细胞吞噬能力的影响

校正吞噬指数a值代表了小鼠吞噬细胞的吞噬能力，由表1可知:所有剂量组的 a值虽高于对照组，但只有中剂量组吞噬细胞吞噬碳颗粒的能力显著高于对照组(P＜0.05)。因此剂量与吞噬能力之间没有线性关系，只有在适当剂量时，才有明显的促吞噬能力，剂量过高或过低，对吞噬能力都没有明显的影响。

表1 酶解物对小鼠吞噬细胞吞噬能力的影响(n=8，x¯±s)Tab.1 Effect of the hydrolysate on the phagocytic capacity of macrophages in the mice

2.2 对体液免疫的影响

持续灌胃30 d，各剂量组小鼠脾细胞特异性抗体的生成量显著高于对照组(A430=0.00515±0.00212)，并且高剂量组(A430= 0.01518±0.00670)显著低于低剂量组(A430= 0.03575±0.01680)和中剂量组(A430=0.02220±0.00470)，P＜0.05，而低剂量组和中剂量组差异不显著(P＞0.05)。说明随着灌胃剂量的增加，酶解物对体液免疫的促进作用有逐渐降低的趋势。

2.3 酶解物对细胞免疫的影响

阳性对照孔的刺激指数(SI)设定为1，在体外实验中，低(0.01 mg/mL)、中(0.1 mg/mL)、高(1 mg/mL)3个剂量孔的SI值均大于1，分别为(1.18±0.06)、(1.24±0.03)和(1.01±0.04)，说明各浓度的酶解物均可促进T淋巴细胞的增殖，但中剂量的刺激指数显著高于对照组和其他两个剂量组。

3 讨论

免疫分为固有免疫和适应性免疫两种类型［4］。适应性免疫即特异性免疫又分为体液免疫和细胞免疫［10］。评价某种物质对免疫功能的影响时，应该对组成免疫力的上述三方面进行全面评价［11］，每一方面的评价又有许多不同的方法，本研究分别选取了碳粒廓清试验、定量溶血试验以及MTT法对免疫力进行评价。

3.1 酶解物对小鼠非特异性免疫功能的影响

吞噬细胞主要由中性粒细胞和单核巨噬细胞组成，其吞噬能力是构成非特异性免疫的要素之一［4］，吞噬细胞也是一类主要的抗原呈递细胞，在特异性免疫应答的诱导与调节中起关键作用，校正吞噬指数可反映吞噬能力的强弱和非特异性免疫功能的变化。中剂量羊骨胶原酶解物可显著提高小鼠外周血中吞噬细胞清除碳颗粒的能力，因而具有增强非特异性免疫的功能。其机理可能是小肽作为一种免疫激活剂，激活大量处于静息状态的巨噬细胞，同时又显著提高了已经处于活化状态的巨噬细胞的吞噬功能［12］。

3.2 酶解物对小鼠体液免疫功能的影响

抗体水平是反映机体免疫状态的重要指标［14］。在SRBC刺激下，脾脏B细胞活化、增殖、分化为浆细胞并分泌各类特异性免疫球蛋白即抗体，介导体液免疫应答。在体外，抗SRBC抗体与SRBC特异性结合，在补体的参与下导致红细胞裂解，发生溶血，所释放的血红蛋白量可反映抗体的生成量，在一定程度上代表了机体的体液免疫水平。本研究中酶解物能显著提高各剂量组小鼠的体液免疫应答能力，同从羊胎盘中提取的小分子肽一样对体液免疫具有正调节作用［14］。检测体系中，各处理组B淋巴细胞的数量是一样的，A值不同由抗体分泌量不同引起，因此羊骨酶解物可提高浆细胞分泌特异性抗体的能力，是否和羊胎盘肽一样还具有促进B淋巴细胞增殖和分化的能力，还有待进一步研究。

3.3 酶解物对小鼠细胞免疫功能的影响

四甲基偶氮唑(MTT)比色分析法简便、迅速、准确，已广泛用于检测细胞毒性、细胞活性以及细胞增殖试验［16］。刀豆蛋白 A(concanavalin A，ConA)为T细胞丝裂原，激活并促进T淋巴细胞增殖。细胞在增殖过程中，能量代谢增加，酶促反应随之加强，MTT被活细胞的线粒体脱氢酶降解而产生紫色物质，因此MTT法可定量分析细胞增殖。本研究主要考察了酶解物与ConA协同刺激脾脏T淋巴细胞的增殖作用。各浓度的酶解物对T淋巴细胞的增殖都有促进作用，但中剂量最强，高剂量最弱。研究酪蛋白酶解产物对ConA诱导的小鼠脾T淋巴细胞增殖活性的影响时，发现酶解产物对小鼠脾淋巴细胞增殖呈现一定的浓度效应，每种产物都有其最适作用浓度［6，7］，这与本文的研究结果一致，这种情况也类似于ConA，ConA在高浓度时其促转化能力反而也有所降低［17］，可能与细胞死亡有关。

综上所述，羊骨胶原木瓜蛋白酶水解物可增强小鼠的非特异性免疫应答和特异性免疫应答能力，但这种促进作用与浓度并非呈正比，关于羊骨胶原活性肽增强免疫的机理有待进一步深入研究。

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Immunomodulatory Effect of Papain Hydrolysate Originated from Sheep Bone on Mice

HUO Nai－rui1，YUE Wen－bin1，LIU Yu－hua2，MA Li－zhen3，KONG Bao－hua2
(1.Shangxi Agricultural University，Taigu 030801，China;2.Northeast Agricultural University，Harbin 150030;3.Tianjin Agricultural College，Tianjin 300384)

ObjectiveTo evaluate the effect of papain hydrolysates originated from sheep bone on the immunity of healthy mice.MethodsICR mice were divided by body mass into control(0 g/kg)，low－dose(0.5 g/kg)，mediumdose(1.0 g/kg)and high－dose(3.0 g/kg)groups.Carbon clearance test and quantitative SRBC hemolysis test were used to determine the impact of the hydrolysates on mice innate immunity and humoral immunity，respectively，and MTT assay was used to determine the effect of low(0.01 mg/mL)，medium(0.1 mg/mL)，high(1 mg/mL)concentration of the hydrolysates on the cell－mediated immunity(CMI).ResultsOnly the hydrolysate of medium dose group significantly enhanced the phagocytic capacity of macrophages.The amounts of antibodies produced by splenic cells of all dosage groups were markedly higher than that of the control group，while antibodies produced by high－dose group were significantly lower than the other two groups.Supplementation of different concentrations of hydrolysates significantly enhanced lymphocyte proliferation in response to ConA stimulation in vitro，but high concentration was not as good as low and medium concentration.ConclusionsSheep bone collagen papain hydrolysates has a potential to enhance both the specific and innate immunity of normal mice，but this kind of immunomodulatory activity shows no linear relationship with the dosage administrated.

Sheep bone;Papain hydrolysate;ICR mice;Immunity

R－33

A

1005－4847(2010)05－0417－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.013

2010－01－25

山西农业大学引进人才科研启动项目(编号:XB2009019);天津市科技攻关项目“羊肉新技术应用与产品开发和工程示范”(编号:05ZHGCNC00100)。

霍乃蕊(1972－)，女，副教授，博士.研究方向:食品生物技术。Email:tgnrhuo@163.com

马俪珍，Email:malizhen－6329@163.com