原花青素对脑缺血再灌损伤大鼠模型的影响

郭学军，陈苑，巫志锋，张永斌，邹移海

(1.广州中医药大学实验动物中心，广州 510405;2.广东省中医院，广州 510405)

原花青素对脑缺血再灌损伤大鼠模型的影响

郭学军1，陈苑1，巫志锋2，张永斌1，邹移海1

(1.广州中医药大学实验动物中心，广州 510405;2.广东省中医院，广州 510405)

目的 研究原花青素对脑缺血/再灌损伤(ischemia/reperfusion，I/R)大鼠神经功能评分(neurological deficit score，NDS)、脑梗死体积、脑含水量等指标的药理作用。方法 采用大鼠大脑中动脉阻断(middle cerebral artery occlusion，MCAO)法复制类似人类缺血性卒中的I/R损伤模型。结果 该模型各时间点内均有程度不同的神经功能缺失，原花青素给药组神经功能评分明显低于对照组(P＜0.05)，假手术组大鼠均无神经功能缺失，脑水肿情况均较对照组明显改善(P＜0.05)，脑梗死体积与盐水对照组相比差异有显著性(P＜0.05)，而假手术组均未见有梗死灶。结论 原花青素具有一定的保护大鼠I/R后受损脑组织的作用，可供后续研究，并可为缺血性卒中使用原花青素治疗提供确凿的理论依据。

原花青素;脑缺血;再灌注损伤;神经生长因子

脑血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)是危害人类健康及生命的三大疾病之一。我国CVD的患病率约为5.0%，发病率约为2.0%，且有缓慢上升的趋势，每年新发病例超过150万例。缺血性脑血管病(ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是其中常见的一类，约占56.6% ～80.0%，在祖国医学中，属于脑卒中的范畴，不仅西医治疗该疾病有相关的治疗方案，而且关于ICVD的中药及植物提取物治疗也有相当长的研究历史。临床上治疗ICVD的单味中药大多属于活血化淤的范畴，如川芎、丹参、当归、三七、地龙、水蛭等。用于治疗ICVD常用的复方制剂剂型除传统的口服煎剂、丸剂、片剂、胶囊剂、口服液、冲剂、膏剂、散剂、丹剂外，涂膜剂之外，其他给药途径也很丰富。如采用中药离子导入、中药灌肠剂，尤其是中药注射剂型，如清开灵、醒脑静、血塞通、生脉、脑络灵、络泰、路路通、心脑新等注射液［1］的开发应用大大提高了中药治疗 ICVD的成功率。

因此，中药、天然药物在 CVD的临床治疗方面具有明显的开发优势，原花青素的现代药理研究表明，其提取物具有抗氧化剂活性、酶抑制活性、抗致突变活性、降低毛细血管通透性(抗炎活性)、心血管活性等多方面的药理作用［2－5］，而当脑缺血缺氧发生后，一系列损伤级联反应的产生将导致脑组织的损害［6］，故可以延伸为此方面的应用，但是原花青素或其提取物是否具有确切的脑保护效应，未见国内外报道过相关的动物基础研究。本研究采用大鼠大脑中动脉阻断致局灶性I/R损伤模型，此模型与人类缺血性卒中较为类似，从神经功能评分、脑梗死体积、脑含水量等方面研究原花青素对大鼠 I/R后的药理作用，为使用原花青素治疗缺血性卒中提供确凿的理论依据，从而拓宽其应用范围。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养条件

SPF 级 SD(Sprague－Dawley，SD)雄性大鼠 120只，体质量270～300 g，购于广州中医药大学实验动物中心［SYXK(粤)2008－0020］，饲养于广州中医药大学实验动物中心 SPF级实验室［SYXK(粤)2008－0001］。饲以标准颗粒饲料，自由饮水。饲养环境温度为 18～22℃，室内湿度保持在 50% ～70%，每天日照时间为8:00～20:00。

1.2 材料

原花青素由深圳市安心植物科技有限公司提供，使用前与0.3%CMC－Na配成混悬液供测试用(含 量 为 5 mg/mL)。TTC(2，3，4－triphenyl－2H－tetrazolium，氯化 2，3，5－三苯基四氮唑)购自广州化学试剂分装部，分析纯，批号:200107214。Olympus光学显微镜(日本)，BI－2000型图像采集分析系统(成都泰盟)，Sartorius 320－A型电子分析天平(德国)。

1.3 方法

1.3.1 分组与造模方法:120只大鼠适应性饲养1周后，采用随机数值表分为假手术组40只，缺血对照组40只，原花青素治疗组40只。缺血对照组与假手术组给予等体积等渗生理盐水。采用稍加改良的Zea－longa0线栓法制备大鼠MCAO模型。栓线采用单沙尼龙线长4 cm直径0.255 mm，一头顶端用火烧钝，去棱角使其光滑，使顶端直径约0.26 ～0.28 mm，并距头端18 mm处作一标记。酒精清洁后置于1%肝素钠中备用。大鼠术前12 h禁食不禁水，以10%水合氯醛3 mg/kg体重腹腔注射麻醉，大鼠四肢固定于手术台上，颈部备皮，常规消毒铺洞巾，行颈部正中切口，逐层分离并暴露右侧颈总动脉(common carotid artery，CCA)、颈内动脉 (internal carotid artery，ICA)、颈 外 动 脉 (external carotid artery，ECA)，避免刺激迷走神经。在 CCA、ICA、ECA上各置一根3/0丝线，在距 ICA、ECA分叉5 mm处结扎CCA，在 CCA根部结扎 ECA，提拉预置丝线阻断 ICA血流，在其距 ICA、CCA分叉上剪一“V”形切口，将尼龙线烧钝的一端小心沿切口插入，松开提拉线，徐徐向前进18～20 mm，稍遇阻力即停止前进。结扎ICA留置丝线，防栓子脱落。然后逐层缝合皮肤，术后2 h将尼龙线从ICA中撤出，直至头端退至CCA分叉处(感阻力)，进行1、24及72 h再灌注，假手术组仅将栓线插入10 mm使尼龙线置于ICA而未进入MCA，其余步骤同前。术中保持肛温(37±0.5)℃，模型成功的标志是大鼠即刻出现Horner征。凡术中动物死亡、出现蛛网膜下腔出血或无梗死灶均为MCAO模型制作失败，不纳入本实验，再随机补充病例，保证实验动物每组数量不变。原花青素治疗组在缺血前1 h及再灌损伤前1 h分别给予原花青素(10 mL/kg)灌胃预防给药。

1.3.2 观察指标及检测方法

(1)神经功能评分

于处死前参考 Zea－Longa等的 5分制评分标准［7］:0分:无明显神经病学症状，活动基本正常。1分:不能完全伸展左侧前爪。2分:爬行时出现向左侧转圈。3分:行走时向偏瘫侧(左侧)倾倒。4分:不能自动行走，有意识障碍。在规定时间点由协作者盲法评分。

(2)脑梗死区含水量测定

采用 Rosenberg［8］方法，采用干湿重法，在缺血再灌注12 h后行过量麻醉，直接断头后取缺血侧自Bregma点向前取5 mm2大小脑组织脑组织，用滤纸吸去表面液体，分别用电子天平称其湿重(室温15～20℃，相对湿度为70% ～90%)，然后将脑组织置于电热烤箱(100±21)℃内48 h烘干并衡重，迅速测干重，按下式计算:

(3)脑梗死体积测定

红四氮唑(2，3，5－triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法染色。实验大鼠在规定时间点作神经功能评分后，用10%水合氯醛3 mg/kg静脉麻醉后迅速开胸，经左心室插管灌入生理盐水50 mL，继之灌以温生理盐水配制的2%TTC 80 mL，灌注时大鼠浸在37℃水中，持续30 min，而后灌注4%多聚甲醛200 mL，持续1 h左右，开颅取脑。TTC被脑组织线粒体内过氧化氢酶还原，可使正常脑组织被染成深红色，梗死灶为白色。将固定后的脑组织由前至后每隔2 mm厚度作冠状面切开，按 Swanson［9］间接法测定，即按顺序依次由前向后，由扫描仪将图像信息输入计算机，用图像采集分析系统分别测定脑梗死面积，输入片厚参数，计算出梗死体积 (mm3)。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 神经行为学改变

从表1可看出，术后存活大鼠I/R 1h后均有程度不同的神经功能缺失，原花青素治疗组神经功能评分明显低于对照组(P＜0.05)，假手术组大鼠均无神经功能缺失。

2.2 脑含水量变化

除假手术组外，各组在I/R后1 h脑含水量就开始增加，到I/R后24 h，盐水对照组与原花青素用药组的脑组织含水量均达峰值。在I/R后72 h有所回落。原花青素用药组在I/R后各时间点脑水肿情况均较对照组明显改善(P＜0.05)，见表1。

表1 原花青素对大鼠神经功能评分的影响(±s，n=40)Tab.1 Impact of procyanidins on the neurological deficit score in rats

表1 原花青素对大鼠神经功能评分的影响(±s，n=40)Tab.1 Impact of procyanidins on the neurological deficit score in rats

注:与对照组比较，*P＜0.05Note:compared with the control group，*P＜0.05

组别Groups神经功能评分(Neurological deficit score)1 h 24 h 72 h对照组(Control group)1.92±0.36 3.11±0.87 3.02±0.43原花青素组(Procyanidins group) 1.54±0.21*1.76±0.37*2.57±0.62*假手术组(Sham－operated group)000

表2 原花青素对大鼠脑含水量的影响(±s，n=40)Tab.2 Impact of procyanidins on brain water content in rats

表2 原花青素对大鼠脑含水量的影响(±s，n=40)Tab.2 Impact of procyanidins on brain water content in rats

注:与假手术组比较，#P＜0.05;与对照组比较，△P＜0.05Note:Compared with the sham－operated group，*P ＜ 0.05;Compared with the control group，*P＜0.05

脑含水量(%)(Brain water content)1 h 24 h 72 h对照组(Control group) 77.20±0.35# 86.5±0.63# 81.55±0.62组别Groups#原花青素组78.32±0.41手术组(Sham－operated group)75.41±0.28 77.11±0.37 77.38±0.70(Procyanidins group) # 82.17±0.82#△ 79.41±0.74#△假

2.3 脑梗死体积

原花青素治疗组I/R后各时间点梗死体积与盐水对照组相比差异有显著性(P＜0.05)，两组在 I/R假手术组均未见有梗死灶。见表3。

表3 原花青素对大鼠脑梗死体积的影响(±s，n=40)Tab.3 Impact of procyanidins on volume of cerebral infarction in rats

表3 原花青素对大鼠脑梗死体积的影响(±s，n=40)Tab.3 Impact of procyanidins on volume of cerebral infarction in rats

注:与对照组比较，*P＜0.05Note:compared with the control group，*P＜0.05

脑梗死体积(mm3)Volume of cerebral infarction(mm3)组别Groups1 h 24 h 72 h对照组(Control group)106.0±9.7 136.5±11.3 162.7±17.8原花青素组(Procyanidins group) 98.4±8.5 107.3±14.8*122.5±20.1*假手术组(Sham－operated group)000

3 讨论

近期分子水平对缺血性卒中的研究资料表明，脑组织缺血缺氧发生后，是一系列损伤级联反应造成脑组织的进一步损害，包括兴奋毒性氨基酸释放，Ca2+超载，炎症反应及促凋亡的发生。目前对于缺血性卒中的脑保护治疗日益重视，主要通过降低一些脑缺血后损伤因子和增加一些保护因子及减少凋亡等达到保护缺血脑组织受损的目的［10－12］。目前利用大量离体和在体的脑缺血动物模型，已发现了许多中药、天然药物能通过干预上述某一损伤或保护环节，不同程度的减轻脑损伤，但是仍有大量中药的基础研究尚未系统的进行，从而限制了临床的应用，而作为原花青素则是在此前提下提出的。本研究主要从神经行为学和病理组织学方面研究原花青素对I/R缺血组织的保护效应。

本文采用了与人脑血循环及再灌注损伤很接近的MCAO模型，在脑缺血2 h后再灌注。发现动物死亡率低，梗死灶及神经功能较稳定。本实验中排除了术后无梗死灶大鼠2只，出现蛛网膜下腔出血大鼠5只。研究结果表明，原花青素能显著促进I/R后大鼠的神经功能恢复，在 I/R后72 h更为显著，大大改善了大鼠脑梗死后的预后。同时原花青素治疗组还能显著缩小I/R后脑梗死体积及显著降低脑水肿的反应，在I/R后24 h，原花青素减轻脑水肿反应的效果更显著。从而最直观的从大体组织水平上显示了原花青素对脑组织的保护作用，为受试动物的神经行为学改变提供了病理学依据。在I/R后1 h，我们发现无论是神经行为，还是脑含水量及脑梗死体积，原花青素治疗组与对照组之间均有显著性差异，这可能因为在脑梗死的超早期，神经细胞、细胞间隙内的脑组织基质受损都较轻，发生坏死及凋亡等变化的神经元及胶质细胞较少，炎症反应较轻，其神经元的形态变化处于代偿状态，缺血区改变尚处于未完全受损的状态，损伤的级联反应尚在启动中，原花青素在缺血即刻及再灌注即刻给予干预，能够减弱损伤级联反应及再灌注损伤，提示原花青素可通过在脑梗死超早期给药从而起干预治疗的药理作用。

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Effects of Procyanidins on Ischemia/Reperfusion Brain Damage in Rats

GUO Xue－jun1，CHE Yuan1，WU Zhi－feng2，ZHANG Yong－bin1，ZOU Yi－hai1
(1.Laboratory Animal Center，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China;2.Guangdong Provincial Hospital，Guangzhou 510405)

ObjectiveTo study the effects of procyanidins on neurological deficit score，cerebral infarction volume，and cerebral water content after ischemia/reperfusion(I/R)in rats.MethodsThe middle cerebral artery occlusion(MCAO)－induced focal I/R brain damage model of rats similar to human ischemic stroke was used.ResultsThe results showed that procyanidins lowered the neurological deficit score，cerebral infarction volume and cerebral water content significantly at intervals of 1 h，24 h and 72 h after I/R(P ＜ 0.05)，vs.control，while the sham－operated rats showed no infarction area.ConclusionsOur findings suggest that procyanidins show certain protective effect against I/R damage in the rat brain.Further studies of this effects are warranted to provide sufficient materials supporting the application of procyanidins in the treatment of ischemic stroke.

Procyanidins;Cerebral ischemia;Reperfusion injury;Nerve growth factor;Rat

R743.31，R332

A

1005－4847(2010)05－0425－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.015

2010－03－29

郭学军(1976－)，男，助理研究员，主要从事实验动物学和药用动物学的研究。E－mail:dwzxgxj@gzhtcm.edu.cn