浅析BDNF改善痴呆老龄鼠记忆障碍CA1区GrayⅠ型突触结构相关参数的变化

王丽萍，王靖宇，姜长斌

(1.大连大学附属中山医院，大连 116001;2.大连医科大学实验动物中心，大连 116001 3.大连医科大学第二临床医院，大连 116027)

浅析BDNF改善痴呆老龄鼠记忆障碍CA1区GrayⅠ型突触结构相关参数的变化

王丽萍1，王靖宇2，姜长斌3

(1.大连大学附属中山医院，大连 116001;2.大连医科大学实验动物中心，大连 116001 3.大连医科大学第二临床医院，大连 116027)

目的 探讨BDNF(Brain derived neurotrophic factor)改善痴呆老龄鼠记忆障碍的机制。方法 利用Morris迷宫试验观察脑内微量注射BDNF对痴呆小鼠自发活动和记忆巩固过程的影响，应用透射电镜和形态计量学分析痴呆老龄鼠海马GrayⅠ型突触的突出结构参数的变化。结果 BDNF使痴呆小鼠在新异环境中的自发活动和探究行为明显增多;并显著延长电击后24 h的步入潜伏期(STL);BDNF使痴呆老龄鼠海马CA1区GrayⅠ型突触的体积密度、面积密度、比表面和面数密度较治疗前增大，突触平均面积增大;突出界面曲率、突出间隙宽度、突出后致密物质均较治疗前增大，而较正常对照组减小。结论 突触结构的变化和突出数量的减少是痴呆发病的病理机制之一;BDNF能够促进突触重建，改善痴呆老龄鼠的学习记忆。

老年性痴呆;脑源性神经营养因子;海马 ;突触

脑源性神经营养因子是神经生长因子家族中的一员;是神经生长和功能活动必须的多肽类因子，存在于神经系统，且能够在脑内选择性作用于前脑胆碱能神经元。它对老年性痴呆(Alzheimer's disease)的防治作用受到国内外学者的关注。我们以往的实验证明［1］，NGF可以改善痴呆老龄鼠的学习记忆功能，考虑到学习记忆与神经元突触改变有关，本工作进一部观察了BDNF改善痴呆老龄鼠记忆障碍同时，探讨相关区域神经突触的变化。对揭示BDNF在痴呆治疗的相关形态学变化中的作用具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 实验对象

本工作选用18月龄90只(SPF)级 ICR小鼠，在大连医科大学实验动物中心进行相关实验［生产许可证号:SCXK(辽)2008－0002使用许可证号:SYXK(辽)2008－0002］。体重48±3.5 g。室温，自由进食饮水，12 h昼夜。

1.2 实验方法

以Morris水迷宫试验测试小鼠空间学习记忆，证实存在智能障碍，并分为用药组和对照组。

1.3 脑内微量注射

按文献［2］报道方法进行定位 ，以微量泵进行海马内注射。

1.4 电镜样品制备

取治疗组、对照组和正常组各20只，用脊髓离断法将小鼠处死，使脑组织充分固定取脑。行常规电镜包埋与轴铅双染色，每份标本观察3张铜网，每张铜网由左上向右下移动，并随机拍摄5张10000倍显微照片，在经光学放大至30000倍。

1.5 形态计量方法

在放大30000倍条件下，按郑富盛方格点阵计数及截距法［2］和龚云等［3］方法对 GrayⅠ型突触的体积密度(Vv)、面积密度(Sv)、比表面(δ)平均面积(Ā)面数密度(NA)，突触界面曲率、突触间隙宽度及突触后致密物厚度等结构参数进行计量分析，用 SPSS软件包统计，求得平均值，标准差，行 t检验。

2 结果

2.1 逃避潜伏期比较

行为空间记忆两组痴呆老龄鼠用药后自发运动减少，食欲不振，对外界刺激反应迟钝。治疗组术后48 h死亡3只，对照组术后48 h内死亡2只，治疗前各组潜伏期延长。治疗后对照组无明显改变。BDNF组治疗后潜伏期缩短。表1结果显示治疗组及对照组与正常组比较小鼠均存在空间记忆障碍(P ＜0.01)，海马注入 BDNF后，行为空间记忆状况好转。与对照组及治疗前比较相应指标有明显变化(P ＜0.01)。

表1 Morris水迷宫检测痴呆老龄鼠平均逃避潜伏期比较Tab.1 Result of average escape latency(s)in each group of Morris labyrinth test

2.2 痴呆老龄鼠相关突触参数变化

痴呆老龄鼠海马CA1区Gray通过表2我们可以看出，突触的体积密度(Vv)、面积密度(Sv)、比表面(δ)面数密度(NA)较对照均减小，平均面积(ā)较对照组增大。表2结果说明痴呆老龄鼠相关突触参数，在治疗前与正常组比较明显降低(P＜0.01)，既突触丢失。而GrayⅠ型突触平均面积ā增大，可能症状改善的主要原因。

表2 海马CA1区GrayⅠ型突触结构参数Tab.2 Intrahippocampal CA1 area GrayⅠ

2.3 突触结构相关参数的变化

痴呆老龄鼠海马CA1区GrayⅠ型突触结构相关参数;治疗后突触界面曲率无明显变化，突触间隙变窄，突触后膜致密物质增加(表3)。学习记忆减退时突触间隙增大［6］本实验在痴呆老龄鼠海马CA1区GrayⅠ型突触的突触间隙变宽(图1)，治疗后突触数量增加同时突触间隙变窄(P＜0.01)(图2)(图1～2见彩插5)。

表3 小鼠海马CA1区突触结构参数的变化Tab.3 Changes of structural parameter of synaptic interface in CA1 in rat

3 讨论

BDNF对周围和中枢神经元有广泛的作用［4］。BDNF通过与突触后膜受体结合能促进背根节、三叉神经节、节状节、三叉神经中脑核等感觉神经元的存活和突起的生长。BDNF通过不同的途径分别促进不同的基因表达或蛋白合成，发挥着不同的作用［5］。BDNF主要促经胞体的发育与相关报道一致［6］。因此，BDNF对神经元损伤修复与再生起重要作用，具有广泛的临床应用价值.BDNF被认为是一种由感觉神经元释放的顺行性营养信息因子来影响NGF和调节感受伤害信息的反应.它可能具有改善智能的作用［7］。外源性 BDNF可以减少脊髓内运动神经元的死亡［8］。BDNF有可能通过其受体而发挥存活与再生效应。

学习记忆功能减退是脑老化的一个重要表现，BDNF与中枢神经系统突触的结构和功能的可塑性密切相关［2］。衰老时突触数量减少，结构异常及长时程突触后电位增强(LTP)的快速衰减，在Alzheimer病患者某些脑区也发生突出数量减少等改变［7］。突触是神经元之间结构和功能的接触点，它的结构和功能的完整对于保证神经元获得信息传递、加工和贮存的顺利进行是非常重要的。突触丢失是痴呆学习记忆减退的神经机制之一。突触平均面积增大，一方面残留的突触细胞通过增加自身面积(平均增加40.20%)增加其与受体结合的功能，另一方面胞体增加导致其表面积增加，最终学习记忆状况得以改善。与正常组比较BDNF组相关突触结构参数无明显差异性(P＜0.05)说明海马GrayⅠ区突触结构明显改变，从而只能得以改善，BDNF治疗痴呆可能会达到治本的目的。

本试验提示痴呆老龄鼠海马突触面数密度、面积密度和体密度下降(P＜0.01)与衰老和Alzheimer病脑组织突触的结构参数变化结果是一致的。突触界面曲率是突触结构可塑性的一个重要参数，较大的突触曲率可扩大接触面，保证其释放的递质到达靶部位，减少向周围间隙扩散，提高突触传递效应［8］。痴呆老龄鼠突触界面曲率减小，减少了神经元的接触面，大大降低了神经信息传递的有效性，从而导致学习记忆能力下降。而治疗后，曲率变化明显(P＜0.05)胞体增大。受体增加，症状改善。

突触后膜致密物质衰老使海马CA1突触后膜致密物厚度减小，提示突触后膜上受体与离子通道等发生变化，从而在功能上影响突触传递的效率，学习记忆能力减退。BDNF治疗痴呆的作用机制可能与其增加突触结构及相应参数有关，而治疗后与正常组比较无显著差异性说明BDNF对痴呆的治疗有效。

我们以往的研究表明，BDNF可以使皮层、海马区域酶活性恢复［9］。结合本次试验结果，是否可以推测BDNF可以改善突触结构，使相应受体与NGF结合，从而发挥生物学作用。另外，本次试验还提示GrayⅠ型突触内部分子结构可能发生变化，因此对于进一步在分子水平探讨老年痴呆学习记忆障碍的神经病理机制有重要意义。

［1］邱泽文，王丽萍，姜春玲，等.外源性NGF对痴呆老龄鼠P物质与 ChAT－IR表达的影响［J］.中国比较医学杂志，2006，16(12):720－722.

［2］郑富盛.细胞形态立体计量学［M］.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1990:16.

［3］龚云，冯慎远.锌对大鼠学习记忆的影响及其与海马CA3区和大脑皮质感觉运动区突触界面结构的相关性研究［J］.解剖学杂志，2000，23(1):441.

［4］James RT，Rory C，Vivien W，et al.Axotomy upregulates the anterograde transport and expression of brain－derived neurotrophic factor by sensory neurons［J］Neurosci，1998，18(11):4374－4383

［5］Hyman RA，Hofer M，Barde YA，et al.BDNF is a neurotrophic factor for dopamintergic neurons of substantia nigra［J］.Nature，1991，350:230.

［6］刘丽敏，黄海霞.BDNF和NT－3对胚胎大鼠脊髓神经元生长发育的影响［J］.首都医科大学学报，2002，23(3):201－205.

［7］Geinisman Y.Structural synaptic modifications associated with hippocampal LTP and behavioral learning［J］.Cerebral Cortex，2000，10(10):952－962

［8］Martone ME，Hu BR，Ellisman MH.Altcrations of hippocampal postsynaptic densitics following transient ischemia［J］.Hippocampus，2000，10(5):610.

［9］王丽萍，王海霞，姜长斌，等.脑源性神经生长因子对老龄鼠智能影响的探讨［J］.中国比较医学杂志，2007，8:481.

Analyses of the Effects of BDNF on Memory Ability in Dementia Senile Mice’s GrayⅠof CA1 Area

WANG Li－ping1，WANG Jing－yu2，JIANG Chang－bin3
(1.Affiliated Zhong－shan Hospital of the Dalian University，Dalian 116001，China;2.Laboratory Animal Center of the Dalian Medical University，Dalian 116027，China;3.The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116027，China)

Objective To explore the mechanism of the BDNF on senile dementia mice.Method The senile dementia mice were tested by Morris water maze.The changes of the hippocampus synaptic structural parameters and Gray typeⅠwere studied with transmission electron microscope and morph metric analysis.Result The spontaneous activity and exploratory behavior in the new and abnormal environment were obviously increased.The step－through latency(STL)was prolonged significantly after electrical stimulation.After treatment by BDNF the volume density on area of Gray typeⅠsynapses in CA1 sector of hippocampus were increased significantly，the parameters were decreased compared with the normal mice.Especially，the curvature of synaptic interface，the width of synaptic cleft and the thickness of postsynaptic density were increased compared with the control group，while the parameters were decreased compared with the normal mice.Conclusion The change of the synaptic structure and decrease in the synaptic number is one of the reasons on dementia pathological mechanism.BDNF can promote synaptic reconstruction and improve the memory of senile dementia mice.

Alzheimer’s disease;Brain derived neurotrophic factor(BDNF);Hippocampus;Synaptic

R－33

A

1671－7856(2010)06－0026－03

2010－03－05

图1 对照组痴呆老龄鼠GrayⅠ型突触间隙变宽 (电镜×15000×2)
Fig.1 Synaptic active zone(nm)Was broaden in GrayⅠ (Electric microscope×15000×2)

图2 治疗后突触数量增加同时突触间隙变窄 (电镜×15000×2)
Fig.2 Synaptic active zone(nm)Was narroW doWn and synaptic increased in GrayⅠ(Electric microscope×15000×2)

辽宁省科技计划项目(20054080020大连市科技计划项目(2005E11SF006)。

王丽萍(1968－)，硕士，神经内科副教授，副主任医师。