“百会”透“曲鬓”对急性脑出血大鼠脑组织AQP－4表达影响的实验研究

张国威，邹伟，刘芳，郭新年，赵佳辉，孙晓伟，李丹，于学平，滕秀英，王珑，滕伟

(1.内蒙古民族大学医学院，内蒙古 通辽 028000;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;3.黑龙江省哈尔滨市第一医院，黑龙江 哈尔滨 150010;4.黑龙江省康复医院，黑龙江 哈尔滨 150018;5.黑龙江省中医研究院，黑龙江 哈尔滨 150036;6.哈尔滨医科大学第一临床医学院，黑龙江 哈尔滨 150001)

脑出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)指原发性非外伤性脑实质内出血，约80%发生于大脑半球(基底节70%、脑叶10%)，其余20%发生于脑干和小脑，约占全部脑卒中的20%～30%。急性期病死率约30% ～40%，是脑血管病中发病急、病情重、死亡率高、致残率高的疾病［1］。本实验通过自体血注入法制备脑出血大鼠模型;针刺组大鼠针刺患侧百会透曲鬓穴;运用免疫组化等检测方法，动态观察不同时间点针刺头部腧穴对脑组织中AQP－4阳性细胞表达的影响，探讨针刺头部腧穴对脑出血大鼠脑水肿的拮抗作用，为脑出血的治疗开辟新的领域。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性Wistar大鼠160只，体重(350±20)g，由哈尔滨市兽医研究所提供(符合国家二级动物标准，动物质量合格证书号:SCXK(黑)20060021)。大鼠的饲养环境湿度45%～65%，温度22～25℃。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 健康雄性Wistar大鼠160只，体重(350±20)g。实验前正常饲养1w。造模前禁食12h，禁水6h。随机分为三组:模型组、针刺组、西药组，每组50 只大鼠;每组再随机分为 6h、1d、2d、3d、7d 五个亚组，每个亚组10只大鼠;制备脑出血模型;另设10只正常大鼠作为空白组。

1.2.2 模型制备 根据大鼠脑立体定位图谱［2］确定右侧尾壳核(caudate－putamen nucleus，CPu)位置。参照Rosenberg［3］等报道的方法制作脑出血大鼠模型。将大鼠用10%水合氯醛(350mg·kg－1)腹腔注射麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，使上门齿钩平面比耳间线平面低2.4mm，这样大鼠前囟和后囟在同一水平面上。取头皮正中，备皮消毒，正中切口，长度约1cm，骨膜剥离器剥离骨膜，暴露前囟及冠状缝，取前囟点(Bregma点)右旁开3.5mm，后0.2mm定点，用牙科钻钻直径为1.0mm的圆孔，深达硬脑膜表面，鼠尾酒精消毒，距尾端3cm处剪断鼠尾，用微量注射器取血50ul，将微量注射器固定于立体定位仪上，沿钻孔垂直进针约6mm，将未肝素化的血液50ul以25ul·min－1速度推进尾壳核，留针约2min，缓慢出针。留针期间酒精棉球包扎鼠尾断端伤口。术后局部喷洒庆大霉素，用牙科水泥封闭颅骨创口，缝合头皮，局部皮肤采用碘酚消毒，防止局部感染影响指标观察。

1.2.3 筛选成功模型的方法 大鼠造模完成，待大鼠清醒，采用 Berderson［4］评分法。

筛选成功模型动物。根据Berderson神经体征评分法:轻抓尾巴，提起高于桌面10cm，正常大鼠前爪伸直。0分:无神经功能缺损;1分:脑部病变对侧腕关节、肘关节屈曲，肩内收屈曲;2分:上述体征+向麻痹侧推阻力下降;3分:活动时向麻痹侧打圈(呈追尾状)。

1.2.4 实验动物的干预方法 针刺组针刺患侧“百会”透“曲鬓”穴，30min·次－1，每天1次。针刺方法:大鼠捆绑固定，用28号1寸毫针针刺患侧百会穴透曲鬓穴，取穴方法参照华兴邦等［5］制定的《实验动物穴位图谱》，进针0.8寸，留针30min，期间捻转3次，每次5 min，以200r·min－1速度捻针。西药组给予忆立福稀释液1ml灌胃(按人:大鼠体重为200∶1配置)治疗，每天3次。模型组大鼠于脑出血造模及评分后，给予大鼠类针刺组相同捆绑30min·d－1;类西药组生理盐水1ml灌胃，每天3次。空白组不做任何干预。

1.2.5 统计学分析 采用SPSS 13.0软件进行统计。计量数据以(±s)表示。各实验组间以及时间点的比较采用均值比较，一维方差分析，因子和因变量列，进行方差齐性检验。以P<0.01或P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 为保证筛选成功模型及足量雄性Wistar大鼠能进入结果分析，本实验进行了双倍造模，剔除不成功模型及死亡的大鼠，保证了每个亚组随机足量大鼠进入了最终的结果分析，无脱失值。

2.2 各组大鼠AQP－4阳性细胞表达的免疫组化检测结果

光学显微镜下，DAB显色阳性细胞呈棕黄色或褐色，采用Motic Med 6.0病理图像分析系统，每张片随机观察并计数脑出血区血肿周边5个不重复视野，在400倍视野下，摄入图像分析系统，选择免疫组化分析模块，通过灰度调节，区分视野内阳性信号面积并结合目测进行分析，计算阳性细胞总数。AQP－4阳性细胞主要表达在毛细血管内皮细胞、室管膜上皮细胞、神经胶质细胞(足突)。阳性细胞为空泡状且主要染色在细胞膜上，胞浆及胞核几乎未见染色。

空白组大鼠可见到较丰富的AQP－4阳性细胞表达，在毛细血管内皮细胞和神经胶质细胞呈现均势现象，在个别神经元细胞膜上有微量表达。各造模组大鼠术后均出现不同程度的AQP－4阳性表达上升现象，除7d针刺组，其余造模组与空白组比较差异显著(P<0.01)。7d针刺组AQP－4阳性细胞虽然在数量与空白组差别不大，但在毛细血管内皮细胞上反应稍弱。模型组大鼠术后6h即出现AQP－4阳性细胞表达增多，并呈现毛细血管内皮细胞反应性增多趋势;1d明显增多;2d时大量表达;3d时主要为毛细血管内皮细胞阳性反应并达高峰，胶质细胞表达相对少;7d时在毛细血管内皮细胞和神经胶质细胞阳性表达又逐渐呈现均势现象，阳性细胞仍高于空白组。在6h时间点，针刺组AQP－4阳性表达均较模型组及西药组减少，与模型组比较有差异(P<0.05)。针刺组与模型组1d、2d、3d、7d时间点比较，针刺组 AQP－4阳性表达均较模型组明显减少(P<0.01)。针刺组与西药组1d、2d、3d时间点比较，均有显著差异(P<0.01);6h、7d时间点比较，差异不明显。西药组与模型组比较，2d时稍有差异(P<0.05)，其余时间点无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠AQP－4阳性细胞数的比较(±s)

表1 各组大鼠AQP－4阳性细胞数的比较(±s)

注:各造模组与空白组比较，△P<0.01;针刺组与模型组比较，*P<0.01;针刺组与西药组比较，*★P<0.01;西药组与模型组比较，ωP<0.05。

6h 1d 2d 3d 7d空白组 10 39.38±5.05 39.38±5.05 39.38±5.05 39.38±5组别 例数.05 39.38±5.05模型组 50 55.98±6.40△ 71.62±6.44△ 86.90±7.42△ 93.72±7.23△ 54.88±6.99△西药组 50 52.10±6.71△ 68.72±5.91△ 79.82±5.30△ω 89.12±6.69△ 50.14±6.49△针刺组 50 49.84±4.43△ 53.10±5.26△*★ 63.22±5.60△*★ 65.00±5.90△*★ 45.54±6.49*

3 讨论

3.1 头针疗法在脑出血急性期应用的可行性探讨

头针疗法是以针刺头皮上的特定区、线，用来治疗病证的一种疗法，又称“头皮针疗法”、“颅针疗法”［6］。孙申田等［7］观察到针刺百会透曲鬓穴，中风患者的脑血流图有非常显著的改善，同时发现其变化与手法捻转频率、刺激强度及作用时间等，关系十分密切。邹氏等［8，9］通过复制急性高血压脑出血大鼠模型，观察针刺对血浆内皮素(ET)和降钙素基因相关肽(CGRP)的影响，得出结论:针刺可以通过抑制血管ET和促进CGRP的释放及其生物活性的作用达到治疗急性高血压脑出血的目的。头针疗法作为治疗中风病的有效方法，在急性脑出血的治疗方面更是一个有待深入探讨、前景广阔的研究领域。

3.2 头穴透刺对脑出血大鼠脑组织AQP－4表达影响的探讨

水孔蛋白(aquaporin，AQP)是上世纪九十年代初开始陆续发现的一类跨膜水转运通道蛋白家族，是水分子跨膜转运的主要分子基础，参与调节细胞内外水的平衡，又称水通道蛋白(water channel protein)。现已发现13种水孔蛋白(AQP0－AQP12)［9］。AQP－4主要分布于中枢神经系统血脑屏障和脑－脑脊液屏障的胶质细胞和室管膜上皮细胞，其中胶质细胞足突表达最密集，是胶质细胞与脑脊液以及血管之间的水调节和运输的重要结构基础［10，11］。在缺血、出血、外伤、肿瘤等各种原因引起的脑水肿中发挥重要作用［12］。

Taniguchi等［13］研究了大鼠大脑中动脉阻塞后AQP－4mRNA的表达情况。结果发现，第1d梗死灶周围皮质AQP－4 mRNA的表达上调，第3d达高峰，第7d仍处于较高水平，这种变化与MRI显示的脑水肿形成和消散相一致。Vizuete等［14］研究发现，立体定向注入喹啉(quinoline)可诱导病灶区及同侧纹状体AQP－4mRNA水平升高，其升高来源于活化的肥大胶质细胞，结合Evans蓝标记发现，同侧纹状体区血脑屏障已破坏，但无神经元变性。提示AQP－4的升高与同侧纹状体血脑屏障的破坏相关，具有促进脑水肿的作用。周氏等［15］在脑出血大鼠血肿周围组织水孔蛋白－4表达分析的研究中发现，脑出血(ICH)6h后血肿周围组织邻近毛细血管的AQP－4蛋白表达开始增高，于脑出血第1～3d达高峰期，之后逐渐下降，至第7d仍高于正常水平。在出血侧皮质AQP－4蛋白表达亦相应增加，但不如血肿周围组织明显。得出结论:ICH时血肿成分可诱导AQP－4蛋白表达增加，脑毛细血管周围星形胶质细胞终足表达增强的AQP－4蛋白可能促进水通过血－脑脊液屏障向脑实质流动，直接参与ICH后血管源性脑水肿的形成。以上这些研究提示AQP－4参与脑水肿的形成，抑制AQP－4可望为减轻各种脑病所致的脑水肿提供新的科研思路和治疗途径。

我们分析认为，脑出血后在血肿周围存在明显的毛细血管内皮细胞AQP－4阳性反应性增多，说明ICH时可诱导AQP－4蛋白表达增加，3d时主要为毛细血管内皮细胞阳性反应并达高峰，与脑水肿高峰一致，说明AQP－4可能主要参与脑水肿损伤机制。针刺能抑制AQP－4蛋白表达，表明针刺通过抑制AQP－4蛋白合成和分泌，减轻脑出血后AQP－4导致的脑水肿。我们推测其机制可能为:针刺通过抑制AQP－4蛋白合成和分泌，部分阻断AQP－4参与的ICH后血管源性脑水肿的形成，降低水通过血－脑脊液屏障向脑实质流动而发挥拮抗脑水肿作用;针刺也可能通过降低或减弱AQP－4相关信号传导途径来发挥拮抗脑水肿作用;针刺也可能通过保护血－脑脊液屏障途径反过来减弱AQP－4相关信号传导，其相关机制还有待进一步研究。得出结论:头针疗法在脑出血急性期可能通过抑制内源性AQP－4表达发挥对脑水肿的拮抗作用;西药组无效。

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附图:AQP－4阳性细胞表达的免疫组化检测结果(400倍)