酯水解的动力学常数测定实验的改进

周映华,盛恩宏

(安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽芜湖241000)

酯水解的动力学常数测定实验的改进

周映华,盛恩宏

(安徽师范大学化学与材料科学学院,安徽芜湖241000)

对酯水解的动力学常数测定实验进行改进,通过使用带恒温装置的紫外可见分光光度计,在一定p H值和恒温条件下测定具有三脚架型的二乙烯三胺锌配合物催化磷酸双酯BNPP水解的吸光度随时间的变化,进一步求算出催化磷酸双酯水解的二级速率常数,有助于学生掌握测定配合物催化酯水解的动力学参数。

磷酸双酯;水解;动力学;实验改进;配合物

0 引 言

金属酶的模拟是化学生物学和分子生物学持续关注的研究领域。以金属配合物作为水解酶的模型物来催化酯水解的动力学常数测定是国内外综合性大学的探究性化学实验课程开设的实验,一般是以羧酸苯酚酯为底物,通过紫外可见光谱测定配合物催化酯的水解产物在400nm波长处的吸光度随时间的变化,从而计算出催化酯水解的相关动力学常数。该方法操作简单,方便易行,能达到掌握用分光光度计法测定配合物催化酯水解的基本原理和计算方法的教学目的。

但该方法在计算速率常数时的近似和简化处理使得它不够规范和严谨,不能用于科学研究,具体表现为在:作为催化剂的金属配合物是通过金属离子和配体溶液的简单混合而非分离的配合物,这对于配合物的催化酯水解的机理分析带来一定的误差;由于酯水解以准一级反应处理,要求底物浓度远小于配合物的浓度;没有在恒温的条件下测定,会引起动力学数据的波动;生物体中的水解底物多为自水解很慢的磷酸酯而非自水解较快的羧酸酯。

由于动力学常数测定实验在大学化学的高年级中开设,为了正确引导学生设计化学实验,对此进行了改进,用带控温装置的紫外可见光谱仪代替普通分光光度计,并在恒温条件下进行实验,用O rigin或excel软件处理实验数据,进一步计算配合物在溶液中各活性物种催化酯水解的二级速率常数,丰富和扩展了实验内容。改进的实验方法不仅可用于教学,也可用于科学研究。天然水解酶的活性中心一般是三脚架型的锌配合物,而底物DNA或RNA含有磷氧二酯键,所以为了研究水解酶的作用机理,选择二乙烯三胺锌配合物(ML)作为金属水解酶的模型物,对硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)作为水解底物。

1 原理

对硝基苯酚磷酸二酯(BNPP)的水解反应按下图所示。BNPP水解产生的HNP在溶液中以HNP和NP-两种形体存在,400nm波长下的吸收实际是NP-的吸收,A=εNP-cNP-。一定温度和p H下,cNP-/cHNP为定值,因此,为便于水解速率数据的处理,设定A=εobscHNP(εobs为HNP的表观摩尔吸光系数,εobs=εNP-cNP-/cHNP),水解产物HNP的总浓度cHNP=A/εobs,水解速率可用关系式dc/dt=(dA/dt) ·(1/εobs)计算得到。而εobs=KεNP-/(K+[H+]),其中在323K时HNP离解常数K=2.47×10-7,400nm的εNP-= 18700 L mol-1cm-1,可以计算出各pH下的εobs值[1]。

以二乙烯三胺锌配合物作为水解酶模型,在p H7.00 -9.00条件下分别研究了模型物催化BNPP水解的行为。模型物催化水解的反应速率表示为:

v为总的反应速率,包括各种催化因素对水解速率的贡献。通过初始斜率法(即水解转换率<2%水解是一级反应)体系的吸光度A对时间t作图,所得直线斜率即为dA/dt,再根据公式(1)求算出v。在模型物过量的条件下,又由公式(2)求算出准一级速率常数kobs。在模型物过量的条件下,水解反应对BNPP为准一级反应。若不存在催化剂时,底物也能慢慢水解,这是缓冲溶液中的OH-所起的碱催化和自水解的作用结果[2]。

上式中[ML]T为配合物的总浓度,kOH-为缓冲溶液催化水解的二级速率常数,kML为配合物催化酯水解反应的二级速率常数,ko为溶剂化引起的自水解速率。在一定pH值下,固定BNPP的浓度,以kobs对[ML]T作图,进行线性拟合得到的斜率即为kML,所得的截距对[OH-]再线性拟合而得到的斜率和截距分别为碱催化的二级速率常数kOH-及自催化速率ko。

在配合物催化酯水解过程中,主要是配合物的羟基活性物种ML(OH)亲核进攻磷脂键,所以有:

然后根据kML-[H+]图进行非线性拟合,求算出活性物种催化BNPP水解的二级速率常数kcat和配合物ML的去质子解离常数Ka。以上催化速率常数的计算冗长而繁琐,建议使用Origin或excel程序来进行这些计算和作图。

2 仪器和试剂

2.1 仪器

Cary 100紫外可见分光光度计(带恒温装置),p H-3C酸度计,电子分析天平,计算机,容量瓶(100mL6个, 10mL 2个),1m L和5m L刻度移液管各1支,100μL移液枪,恒温水槽。

2.2 试剂

高氯酸,氧化锌,二乙烯三胺(L),三羟甲基胺基甲烷(Tris),盐酸,NaClO4,对硝基苯酚磷酸二酯(BNPP),以上试剂均为分析纯;二次蒸馏水。

3 实验步骤

3.1 配合物的合成

(1)Zn(ClO4)2·6H2O的合成:将等物质的量的氧化锌与高氯酸混合,搅拌反应20 min,在蒸发皿中水浴蒸发浓缩,结晶,再重结晶,用乙醚洗涤,真空干燥。

(2)配合物ZnL(H2O)(ClO4)2的合成[3]:将1.490 g, 4 mmol Zn(ClO4)2·6H2O溶解在10m l甲醇中,缓慢滴入到10 m l的含0.60 mL,4 mmol二乙烯三胺(L)的甲醇溶液中,搅拌反应30 min,蒸发浓缩结晶,用乙醚洗涤,真空干燥。

3.2 溶液的配制

(1)100 m L0.050M Tris-HCl缓冲溶液(I=0.10M NaClO4):分别称取1.225克NaClO4和0.606克Tris,溶解在约90m L双蒸水中,用1mol/L的盐酸调节到所需p H值(分别为7.00,7.40,7.80,8.20,8.50,8.80),定容至100mL。

(2)10 mL3mM BNPP储备液:准确称取0.0109 g对硝基苯酚磷酸二酯钠,溶解在少量的新鲜双蒸水中,定容至10 mL。

(3)10m L0.06M的ZnL(H2O)(ClO4)2储备液:准确称取0.2571g合成的ZnL(H2O)(ClO4)2,溶解在少量的新鲜双蒸水中,定容至10 m L。

3.3 动力学测试

(1)将缓冲溶液、配合物储备液、BNPP储备液在323K的恒温水槽中恒温10 min。启动紫外可见分光光度计及其动力学程序,控温附件预设323K,预热仪器20 min。

(2)在1cm的比色皿中依次加入0.06M配合物溶液(10,20,40,60,80,100μL)、一定量的缓冲溶液、20μL3mM BNPP,使混合溶液总体积为3 mL。

(3)上述混合溶液立即放在紫外可见分光光度计中,以仅不加配合物的相同溶液为参比,检测400nm吸光度A随时间t的变化,取水解转化率小于5%的点,使测定的A-t图呈线形关系,其相关系数大于0.996,测定A-t斜率。每组数据至少平行重复两次。

4 实验结果和数据处理

4.1 计算各p H下的εobs值

由εobs=KεNP-/(K+[H+]),323K时HNP的解离常数K=2.47×10-7,400nm的εNP-=18700 L mol-1cm-1,计算出各p H下的εobs值。

4.2 催化BNPP水解的速率常数

记录测试的温度、p H值和dA/dt,并根据公式(1)和(2)计算出kobs和kML列入下表。

p H 测定温度BNPP溶液浓度CML(mM)0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 dA/dt dA/εobsdtkobs(s-1)kML(M-1 s-1)

4.3 p H对水解速率常数的影响

由上表得出的kML-p H填入下表并根据公式(3)由Origin非线性拟合计算出羟基活性物种ML(OH)催化酯水解的二级速率常数kcat。

p H 7.00 7.40 7.80 8.20 8.50 8.80kML(M-1s-1)kcat(M-1 s-1)

5 思考与讨论

1.为什么可以由εNP-求算对硝基苯酚HNP的εobs?

2.推导配合物催化酯水解的二级速率常数kML与kcat的关系?

3.由kML-p H数据作图的曲线是什么形状,对讨论催化水解机理有何启示,又如何在Origin程序中定制公式拟合kcat?

[1] Chen,J.;Wang,X.;Zhu,Y.;Lin,J.;Yang,X.;Li,Y.; Lu,Y.;Guo,Z.Inorg.Chem[J].2005,44:3422-3430.

[2] Yatsimirsky,A.K.Coord.Chem.Rev[J].2005,249:1997 -2011.

[3] Ibrahim,M.M.;Shimomura,N.;Ichikawa,K.;Shiro,M. Ino rg.Chim.Acta[J].2001,313:125-136.

OnImprovementofExperimentalDetermination ofKineticConstantofEsterHydrolysis

ZhouYinghuaShengEnhong
(CollegeofChemistryandMaterialsScience,AnhuiNormalUniversity,Wuhu241000,China)

Theimprovementofexperimentaldeterminationofthekineticconstantofesterhydrolysiswas discussed.AtacertainvalueofpHandtemperature,theabsorbancevariationswithtimeduringthereactionofthephosphatediesterBNPPhydrolysiscatalyzedbythetripodaldiethylenetriaminezinccomplexweredeterminedbymeansoftheUV-Visspectrophotometerwiththethermostaticallycontrolled equipment.Furthermore,thesecondorderrateconstantoftheBNPPhydrolysiswascalculated,which ishelpfulforstudentstoacquaintthekineticconstantdeterminationofestershydrolysiscatalyzedby thecomplex.

phosphatediester;hydrolysis;kinetics;experimentalimprovement;complex

book=0,ebook=95

O614

A

1673-1794(2010)02-0061-03

周映华(1978-),男,理学博士,研究方向:生物无机。

安徽师范大学教学研究项目(xjjyxm200828)

2009-09-27