液态发酵法制备菜籽ACE抑制肽菌种的筛选

鞠兴荣，金 晶，袁 建，王立峰,2，何 荣,2

液态发酵法制备菜籽ACE抑制肽菌种的筛选

鞠兴荣1，金 晶1，袁 建1，王立峰1,2，何 荣1,2

(1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制及深加工技术重点实验室，江苏 南京 210003；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

采用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、白地霉、产朊假丝酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉对菜籽粕进行液态发酵，以氮溶解指数、SN-TCA、氨基酸态氮、肽得率和ACE抑制活性为评价指标，对液态发酵生产菜籽ACE抑制肽的菌种进行筛选。结果表明：在上述菌种中枯草芽孢杆菌液态发酵所得肽得率最高，并且具有最高的ACE抑制活性，菌种优势明显，是液态发酵菜籽粕生产ACE抑制肽的优势菌种。

菜籽肽；液态发酵；菌种筛选；ACE抑制肽

菜籽饼粕是菜籽榨油之后的副产品，其蛋白含量为35%～42%[1]。菜籽蛋白经水解产生的小肽具有多种生物活性，其中ACE抑制肽由于安全性高、副作用少、易吸收，已经成为活性肽研究的热点[2-3]。发酵法制备大豆[4-6]和牛奶[7-8]的ACE抑制肽的研究在我国已有报道，而使用液态发酵制备菜籽ACE抑制肽的研究目前在国内还属于空白，因此具有很高的研究价值。

菌种的选择对菜籽ACE抑制肽的制备非常关键，这主要是因为液态发酵条件下不同的菌种所产的蛋白酶不同，其对菜籽蛋白的作用位点也不相同，导致其水解产物的生物活性差别很大[9]。本实验以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黑曲霉、白地霉、产朊假丝酵母、宇佐美曲霉、雅致放射毛霉对菜籽粕进行液态发酵，以ACE抑制活性为主要评价指标，并考察氮溶解指数、SN-TCA、氨基酸态氮、肽得率，对液态发酵制备ACE抑制肽的菌种进行比较研究，筛选出液态发酵法制备ACE抑制肽的优良菌株。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与菌种

菜籽粕，以Canola菜籽为原料，通过索氏抽提脱油制得，粗蛋白含量43.26%；血管紧张素转化酶(ACE，酶活力0.25U)、HHL、Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma公司。

三氯乙酸(TCA)、甲醛等其他试剂均为分析纯。

Bacillus.subtilis 10160、Candida utilis 1769、Aspergillus niger 2377、Bacillus licheniformis 20006、Geotrichum candidum 31418、Candida utilis 40294、Actinomucor elegans 40252 中国工业微生物菌种保藏中心。

1.2 仪器与设备

立式电热压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂；超净工作台 苏净集团安泰公司；PHS-3C型精密数显pH计、722N紫外-可见分光光度计 上海精密科学仪器厂；GL-20B型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；全温立式振荡培养箱 太仓市实验设备厂。

1.3 方法

1.3.1 斜面培养

将保藏菌种接入基础培养基(按各菌种说明书配制)，在一定温度(霉菌28℃，细菌30℃)、一定时间(细菌24h，霉菌5d)下进行培养，使其转接活化。

1.3.2 菌种活化

挑取两环种子培养基活化后菌株，接入锥形瓶，8层纱布封口，在恒温振荡培养箱中进行扩大培养，控制温度30℃，转速180r/min，细菌培养24h，霉菌培养3d。使其菌体浓度达到108个/mL。

1.3.3 发酵培养

从已制备好的种子培养基中取出一定体积的菌悬液接入已灭菌液态发酵培养基中，液态发酵培养基的料液比1:20(m/V)，接种量为1:20(V/V)，8层纱布封口，控制在30℃，180r/min的恒温振荡培养箱内进行培养，培养一定时间后取样进行测定。

1.3.4 发酵液处理

将培养一定时间的发酵产物取出，2～4℃、4000×g离心15min，测定其上清液体积，用0.45μm微孔滤膜过滤上清液，除去不溶物和细菌，备用。

1.3.5 氮溶解指数测定

参照文献[10]所述方法进行测定。氮溶解指数按式(1)计算。

1.3.6 SN-TCA指数测定

参照文献[11]所述方法，取5mL处理液，加入等体积质量浓度为10g/100mL的三氯乙酸(TCA)，静置30min，2～4℃、5000×g离心20min，取5mL上清液进行微量凯式定氮，测定其氮含量。SN-TCA指数按式(2)计算。

1.3.7 氨基酸态氮得率测定

采用甲醛滴定法[12]测定提取液中－NH2含量，氨基酸态氮按式(3)计算。

1.3.8 肽得率测定

参照文献[13]所述方法，取2.5mL处理液，加入等体积10g/100mL的三氯乙酸(TCA)，静置30min，2～4℃、5000×g离心20min，取2mL上清液，加8mL双缩脲试剂，25℃静置30min，测OD540nm值。肽得率按式(4)计算。

1.3.9 ACE抑制活性测定

参照Cushman等[14]的方法，作出适当的修改，具体步骤如下：用含有0.3mol/L NaCl的0.1mol/L硼酸盐缓冲液(pH8.3)将HHL配制成5.0mmol/L的溶液。取100μL的HHL和40μL的水解产物混合，于37℃保温3min后，加入10μL ACE(溶于蒸馏水，活力为0.1U/mL)，混匀后37℃保温30min，再加入250μL的1mol/L HCl溶液终止反应，再加入1.7mL醋酸乙酯，15s振荡混匀，5000×g离心10min，用移液管吸取1mol/L醋酸乙酯层，真空冷冻干燥2h后，加入3mL蒸馏水，在228nm波长处测定其吸光度。ACE抑制活性按式(5)计算。

式中：A为ACE及ACE抑制肽均参与时所测的吸光度；B为ACE抑制肽不参与时所测的吸光度；C为ACE不参与时所测的吸光度。

2 结果与分析

在预试验基础上，在24～48h内，液态发酵菜籽蛋白的效果较好，所得各项指标均达到最优值，因此，选用在24、36、48h的实验数据来进行分析。

2.1 不同菌种液态发酵对菜籽蛋白氮溶解指数的影响

氮溶解指数反映发酵水解液中可溶性氮的含量，从一定程度上也可以反映发酵效果的好坏。由图1可知，随着发酵时间的增加，各个菌种的氮溶解指数都有所增加，这是由于随着发酵的进行，菌种代谢所产生的蛋白酶将菜籽蛋白逐步水解，产生了易溶于水的小分子短肽和氨基酸。通过比较可以得出：黑曲霉、白地霉、产朊假丝酵母的氮溶解指数在经过一定时间的液态发酵后，与原样相比并没有显著提高，原因可能是液态发酵的环境不适合这几种菌种的产酶或菜籽粕中存在不适合这几种菌产蛋白酶的因子；宇佐美曲霉和雅致放射毛霉的氮溶解指数居中，在50%左右；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的发酵效果最好，其氮溶解指数均超过50%，其中枯草芽孢杆菌在发酵48h的条件下氮溶解指数高达69.4%，说明发酵过程中产生了较多的蛋白酶，使蛋白质大量水解。

图1 不同菌种液态发酵对氮溶解指数的影响Fig.1 Comparison of NSI using different fermentation strains

2.2 不同菌种发酵菜籽蛋白对菜籽蛋白SN-TCA指数的影响

SN-TCA指数是在特定条件下，经过三氯乙酸沉淀后水解产物中可溶性氮的质量分数。三氯乙酸作为一种蛋白质沉淀剂，可以沉淀蛋白质和大分子的肽段，随着反应的进行，蛋白质肽链被切成大小不等的肽段，SN-TCA指数会随之提高，SN-TCA指数可以定性地反应蛋白质的分解情况，溶解指数越高，表明较短肽段的含量越高。

图2 不同菌种液态发酵对SN-TCA指数的影响Fig.2 Comparison of SN-TCA index using different fermentation strains

由图2可知，SN-TCA指数与氮溶指数变化趋势基本相似，黑曲霉、白地霉、产朊假丝酵母的SN-TCA指数同样提高不明显，而其他几种菌种中，也仅有雅致放射毛霉的SN-TCA指数与氮溶解指数变化趋势相比稍有提高，这可能是由于雅致放射毛霉发酵过程中，形成的可溶性蛋白较少，多为小分子短肽和氨基酸，SN-TCA指数表明枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、雅致放射毛霉在液态发酵条件下，短肽和氨基酸的含量较高。

2.3 不同菌种发酵对菜籽蛋白氨基酸态氮得率的影响

图3 不同菌种液态发酵对氨基酸态氮得率的影响Fig.3 Comparison of amino nitrogen yield using different fermentation strains

由图3可知，氨基酸态氮得率与氮溶解指数和SNTCA指数变化趋势基本相似，也是随着发酵时间的延长而逐步增加，这说明各个菌种所产生的蛋白酶在水解蛋白的同时也产生了大量的端肽酶，将短肽水解成氨基酸。尽管黑曲霉的氮溶解指数不高，但是其氨基酸态氮得率却很高，在48h达到了2.71%，这说明黑曲霉在液态发酵的条件下，产生的大多是端肽酶，因此，在水解过程中产生较多的氨基酸。

2.4 不同菌种发酵对菜籽蛋白肽得率的影响

图4 不同菌种液态发酵对肽得率指数的影响Fig.4 Comparison of peptide yield using different fermentation strains

肽得率是发酵处理液中短肽含量与原料总量的比值，它反映了发酵产品中低分子短肽含量的高低，由图4可知，24h是各个菌种肽得率最高的发酵时间，随着发酵时间的延长，各个菌种的肽得率均有所降低，这可能是由于到了发酵的后期，随着发酵时间的延长，各个菌种开始产生大量的外肽酶，将此前所产生的菜籽多肽进一步水解成游离氨基酸，导致多肽含量的降低，由于外肽酶产生的量不同，因此肽得率减少的幅度也有所不同。通过比较可以发现，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌进行发酵所得肽得率最高，可以达到22%左右，宇佐美曲霉次之，而其他菌种发酵的肽得率均不高。因此，枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌比较适合进行液态发酵来生产低分子小肽。

2.5 不同菌种发酵对菜籽蛋白ACE抑制活性的比较

图5 不同菌种液态发酵对ACE抑制活性的影响Fig.5 Comparison of ACE inhibition activity using different fermentation strains

ACE抑制肽也是一种ACE抑制剂，它通过对ACE的抑制而起到降血压作用。ACE抑制活性对于筛选生产ACE抑制肽的菌种来说是一个很重要的指标。由图5可知，大部分菌种的ACE抑制活性在24h达到最大值，随后逐步降低，这是由于对ACE起抑制作用的是一些特定序列的短肽，而随着发酵的进行，短肽被进一步水解，使其不再具有ACE抑制活性。与其他菌株相比，枯草芽孢杆菌的ACE抑制活性明显较高，在发酵24h时可以达到70.5%，次之是地衣芽孢杆菌和雅致放射毛霉，发酵得到的小肽的ACE抑制活性也均超过50%以上，相比其肽得率，宇佐美曲霉尽管肽得率也不低，但发酵所得的小肽ACE抑制活性不高，这可能是由于其所产的蛋白酶作用位点不同，没有得到具有ACE抑制作用的小肽。

3 结 论

本实验通过使用枯草芽孢杆菌等7种菌种进行液态发酵，以ACE抑制活性为主要指标，肽得率等为辅助指标，旨在筛选出适合液态发酵环境，发酵产物中含有较高ACE抑制活性的小肽的菌种。

实验表明，枯草芽孢杆菌对菜籽粕进行液态发酵，可以得到ACE抑制活性较高的小分子短肽，其最高ACE抑制活性超过70%，同时，通过液态发酵得到的肽得率可以达到25%左右，肽得率较高。枯草芽孢杆菌在液态发酵条件下，各个指标的优势都很明显，因此，可以作为液态发酵生产高ACE抑制活性短肽的最佳菌种，用于今后的研究。实验还表明，黑曲霉在液态发酵条件下产生了大量的端肽酶，因此，若与其他菌株进行联用，可以起到脱苦等作用，适合用于混菌发酵。

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Screening of an Optimal Strain for Producing Rapeseed-originated Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptides by Liquid-state Fermentation

JU Xing-rong1，JIN Jing1，YUAN Jian1，WANG Li-feng1,2，HE Rong1,2
(1. College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Key Laboratory of Grain and Oils Quality Control and Deep-Utilizing Technology of Jiangsu Province, Nanjing 210003, China；2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to search for an optimal stain for the production of angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from rapeseed meal by liquid-state fermentation, seven common microorganisms including Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Aspergillus niger, Geotrichum candidum, Candida utilis, Actinomucor elegans and Aspergillus oryzae as a starter for rapeseed meal fermentation were compared for their differences in five fermentation parameters, namely peptide yield, nitrogen solubility index (NSI), amino nitrogen yield, soluble nitrogen in aqueous trichloroacetic acid (SN-TCA) content and ACE inhibition activity. Among the above microorganisms, Bacillus subtilis was found to give both the highest peptide yield and ACE inhibition activity and grow dominantly, thereby being a superior strain for the production of ACE inhibitory peptides from rapeseed meal by liquid-state fermentation.

rapeseed-derived peptide；liquid-state fermentation；strain screening；ACE inhibitory peptide

Q93.331

A

1002-6630(2010)19-0212-04

2010-01-10

国家农业成果转化资金项目(2009C10045)；国家“863”计划项目(2007AA10Z331)；江苏省教育厅自然科学研究项目(08KJB55004)

鞠兴荣(1957—)，男，教授，博士，主要从事食品营养及功能性成分研究与开发。E-mail：xingrongju@163.com