灵芝三萜皂苷(GCTL1)的体外抗氧化作用

崔月花，章克昌

灵芝三萜皂苷(GCTL1)的体外抗氧化作用

崔月花1，章克昌2

(1.扬州大学生物科学与技术学院，江苏 扬州 225009；2.江南大学 教育部工业生物技术重点实验室，江苏 无锡 214122)

采用化学模拟体系研究灵芝三萜皂苷(GCTL1)对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基及过氧化氢自由基的清除能力，测定其还原力和铁螯合力，并与合成的抗氧化剂进行比较。结果表明，GCTL1具有较好的抗氧化作用。GCTL1清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基、过氧化氢自由基的IC50分别为：(0.247± 0.05)、(0.197±0.002)、(0.09±0.02)、(0.279±0.04)mg/mL；还原力为0.5、铁螯合力为50%时GCTL1质量浓度分别为(0.425±0.01)、(0.180±0.04)mg/mL，并且在一定质量浓度范围内具有剂量依赖效应；GCTL1的总体抗氧化能力高于VC和2,6二叔丁基对甲酚(BHT)。

灵芝；三萜皂苷；抗氧化活性；清除率

灵芝(Ganoderma. lucidum)是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属真菌，由于其特殊的药用价值，灵芝有效成分的分析和药理作用的研究受到了广泛的专注[1-5]，尤其在日本、中国、韩国等国家。迄今为止，已从灵芝的子实体、菌丝体及孢子中分离到了150多种化合物，包括糖类、核苷类、呋喃类、生物碱类、氨基酸蛋白质类、三萜类、油脂类、有机锗化合物类[6-7]等。江南大学生物资源室从灵芝发酵液中分离到一个新的化合物——灵芝三萜皂甙(GCTL1)[8]。本实验则进一步综合评价其抗氧化活性，以期为其今后在临床上的应用提供前期实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

GLCT1纯品由江南大学生物资源室分离纯化。分离纯化方法见文献[8]。将灵芝三萜皂苷、对照样品BHT、VC分别溶于甲醇、去离子水中，配制成0.1、0.2、0.5、1mg/mL的溶液，测定其抗氧化性。

铁氰化钾(K3Fe(CN)6)、2,2＇-联吡啶(2,2-bipyridyl)、氯化铁(FeCl3)、三氯乙酸(TCA)、十二烷基磺酸钠(SDS)、盐酸羟胺(HAHC)、2,6二叔丁基对甲酚(BHT)、抗坏血酸(VC)等均为分析纯 中国医药集团上海化学试剂公司；DPPH Sigma公司。

Multiskanmk3酶标仪 美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 GLCT1清除超氧阴离子自由基能力的测定

利用邻苯三酚自氧化法测定GLCT1对超氧阴离子自由基的清除率。方法参照文献[9]，略有修改。在比色管中加入Tris-HCl (pH8.2) 4.5mL、待测样品溶液 1mL、去离子水3.3mL，快速加入10mmol/L邻苯三酚溶液0.2mL，每隔30s在320nm波长处测定吸光度(A320nm)，并计算邻苯三酚自氧化速率(s=)。空白管以各自的溶剂代替样品，以VC、BHT作阳性对照。

1.2.2 GLCT1清除羟自由基能力测定

羟自由基的测定参考文献[10]。在10mL的比色管中加入0.75mmol/L的pH值为7.4的磷酸缓冲液1.0mL、番红(260μg/mL) 0.2mL、EDTA(2mmol/L) 0.375mL、FeSO4(2mmol/L) 2mL，再加入待测样品溶液0.2mL，最后加入体积分数3%的H2O2溶液 420mL，混匀后于40℃水浴保温30min，加入0.5mL 0.15mol/L EDTANa2溶液终止反应，然后在波长520nm处测吸光度(A520nm)。每个样品浓度作3个平行样，取其平均值。空白组以等体积的各自溶剂代替样品溶液，对照组以等体积的各自溶剂代替样品溶液和FeSO4溶液。以VC、BHT作阳性对照。

1.2.3 GLCT1清除DPPH自由基能力的测定

参照文献[11]的方法，略有修改，试管中加入0.5mL待测样品溶液，2.5mL的6.25×10-5mol/L DPPH甲醇溶液，在30℃条件下孵育30min，在517nm波长处测定吸光度记为A样品。甲醇调零，DPPH新鲜配制，每次用前放在4℃条件下暗中保存。VC、BHT作阳性对照，空白组以各自的溶剂代替样品。

1.2.4 GLCT1清除过氧化氢自由基能力的测定

清除过氧化氢的活性测定参照文献[12]进行，略有修改。取待样品溶液0.4mL加入3mL的磷酸缓冲液(pH7.4)中，加入600μL 43mmol/L的H2O2溶液，在230nm波长处测定反应液的吸光度，每10min记录一次，记录40min，测定反应速率(s=)。空白管以溶剂代替样品溶液，VC、BHT作阳性对照。

1.2.5 GLCT1还原力的测定

还原力的测定按文献[13]进行，在试管中加入0.5mL待测样品溶液，2.5mL磷酸缓冲液(200mmol/L，pH 6.6)，2.5mL的质量分数1%的铁氰化钾溶液，在50℃下孵育20min，冷却后加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，并在3000r/min条件下离心，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水，0.5mL 0.5% FeCl3溶液，在700nm波长处测定吸光度，以吸光度代表还原力。VC、BHT作阳性对照，空白组以各自的溶剂代替样品溶液。

还原力=A样品－A空白

1.2.6 GLCT1铁螯合力的测定

铁螯合力采用2,2＇-联吡啶法[14]，反应包括200μL待测样品溶液，100μL 2% SDS、100μL 1.8mmol/L FeSO4溶液、800μL 0.1% 2,2＇-联吡啶溶液(0.2mol/L HCl溶解)、320μL 10%盐酸羟胺溶液、以及800μL Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，在522nm波长处测定吸光度A样品，用已知浓度的EDTA溶液，VC溶液作阳性对照，空白组以各自的溶剂代替样品溶液测定吸光度A空白。

1.2.7 统计分析

所有实验设3次重复，结果以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 GCTL1清除超氧阴离子自由基的能力

图1 不同质量浓度的样品对清除超氧阴离子自由基的影响Fig.1 Concentration-dependent superoxide anion free radical scavenging curves of GCTL1, BHT and vitamin C

超氧阴离子自由基可发生在各种细胞中，可以引起其他的链式反应，产生新的自由基和氧化剂，对细胞产生毒害[15]。由图1可知，在0～0.5mg/mL范围内GCTL1清除超氧阴离子自由基具有剂量依赖效应，相关性系数为0.97。GCTL1、VC、BHT的清除率在50%时3种物质的质量浓度分别是(0.247±0.05)、(0.567±0.04)、(10.1± 0.02)mg/mL，说明GCTL1具有很强的清除超氧阴离子自由基的活性，分别是VC、BHT的2.29、40.89倍。

2.2 GCTL1清除羟自由基的能力

图2 不同质量浓度的样品对清除羟自由基的影响Fig.2 Concentration-dependent hydroxyl free radical scavenging curves of GCTL1, BHT and vitamin C

羟自由基是活性最强自由基，也是毒性最大的自由基，可与活细胞中某些生物大分子发生反应，导致遗传突变、膜损伤、酶失活、线粒体氧化、磷酸化作用等一系列变化[16]。图2表明GCTL1具有清除羟自由基的能力，在质量浓度为0～0.5mg/mL范围内，具有剂量依赖效应，相关性系数为0.98。GCTL1、VC、BHT清除率在50%时3种物质的质量浓度分别是(0.197±0.002)、(0.226±0.003)、(6.96±0.5)mg/mL，说明GCTL1清除羟自由基的能力高于VC和合成的抗氧化剂BHT，分别是VC和BHT的1.14、35.1倍，是一种极强的羟自由基清除剂。已有报道药用真菌如Coriolus versicolor、G. lucidum、G. tsugae的甲醇萃取物在16mg/mL清除羟自由基的能力 38.0%～52.6%[17]，说明纯品GCTL1也可能是抗氧化的重要化合物。

2.3 GCTL1清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是脂溶性自由基的模型。抗氧化剂和DPPH反应，减少的DPPH分子等于抗氧化剂提供的羟基数量，因此，在517nm波长处的吸收接近于剩余DPPH分子的数量，按照动力学分级，依照对时间的特性，已有报道如下：5min前迅速反应，5～30min，反应中速，30 min后，反应变慢[18]。图3说明了GCTL1、VC、BHT对DPPH自由基的清除情况及不同的动力学，在本研究中，GCTL1具有很好的清除DPPH自由基的能力，在5min内就到了稳定的状态，VC在5min内达到稳态，BHT的吸收在35min的时候达到稳定的状态。这和Sanchez-Moreno[19]报道的一致，图4是不同质量浓度的GCTL1、VC、BHT清除DPPH自由基的效应，GCTL1清除DPPH自由基的能力随质量浓度的增加而增加，并在0～0.1mg/mL范围内具有剂量依赖效应。清除率在50%时GCTL1、VC、BHT的质量浓度分别是(0.09± 0.02)、(0.146±0.05)、(3.36±0.3) mg/mL，GCTL1清除DPPH自由基的能力分别是VC、BHT的1.62、37.33倍，可见GCTL1是一种很好的DPPH自由基清除剂。Mau等[20]报道灵芝发酵液甲醇萃取物10mg/mL时对DPPH自由基的清除率为79.3%，可见GCTL1清除DPPH自由基的效果比灵芝发酵液甲醇萃取物好，GCTL1很可能是灵芝发酵液甲醇萃取物中的重要活性物质。

图3 DPPH自由基在3种样品中随时间的变化Fig.3 Kinetic curves of DPPH free radical scavenging by GCTL1, BHT and vitamin C

图4 不同质量浓度的样品对清除DPPH自由基的影响Fig.4 Concentration-dependent DPPH free radical scavenging curves of GCTL1, BHT and vitamin C

2.4 GCTL1清除过氧化氢自由基的能力

图5 不同质量浓度的样品对清除过氧化氢自由基的影响Fig.5 Concentration-dependent hydroxyl peroxide free radical scavenging curves of GCTL1, BHT and vitamin C

过氧化氢自由基也是活性氧，是一种不稳定的自由基，其代谢产生羟自由基和单线态氧，进而和细胞内大分子发生反应，造成细胞损伤[21]。图5表明了GCTL1、VC、BHT清除过氧化氢自由基的能力，在0～0.5mg/mL范围内，3种物质在清除过氧化氢自由基方面都有剂量依赖性，相关性系数为0.95。GCTL1、VC、BHT清除过氧化氢自由基50%的质量浓度分别为(0.279±0.04)、(0.973±0.06)、(10.56±0.06)mg/mL，GCTL1清除过氧化氢自由基的能力分别是VC、BHT的3.48、37.8倍。

2.5 GCTL1的还原力

图6 不同质量浓度样品的还原力Fig.6 Concentration-dependent reducing power curves of GCTL1, BHT and vitamin C

还原力可以作为抗氧化评价的一个重要的指标。从图6可知，GCTL1的还原力随质量浓度增加而增加，还原力在0.5时GCTL1的质量浓度为(0.425±0.01)mg/mL，而VC、BHT的质量浓度为(0.218±0.005)、(13.63±0.6) mg/mL，GCTL1的还原力较VC低，但是合成抗氧化剂BHT的32.07倍，GCTL1可以作为一种较好的还原剂。在相同体系下测定还原力时，灵芝甲醇萃取物质量浓度为1.5mg/mL时的还原力是0.81[17]，说明GCTL1的还原力要好于灵芝甲醇萃取物。

2.6 GCTL1对铁离子的螯合能力

图7 不同质量浓度样品的铁螯合能力Fig.7 Concentration-dependent ferric-chelating capacity curves of GCTL1, BHT and vitamin C

铁离子在食物系统中是最有效的前氧化剂[19]。消除过量的铁离子也能阻断机体产生过量的自由基。因此对金属离子螯合率的测定也是评价抗氧化剂抗氧化性能常用的方法。螯合率愈大，被评价的抗氧化剂潜在的抗氧化性就愈强。图7表明了3种物质对铁螯合能力的情况，说明3者在一定范围内都有剂量依赖性，EDTA具有极好的铁螯合能力，在质量浓度为0.1mg/mL时，螯合率为(94.6±1)%，而GCTL1、VC达到50%的螯合率时的质量浓度为(0.180±0.04)、(0.405±0.02)mg/mL，说明GCTL1对铁的螯合力虽不及EDTA，但对铁离子具有一定的螯合能力，而且在所测浓度范围内具有剂量依赖性。据报道在2.4mg/mL时，药用真菌的甲醇萃取物，如G. Lucidum、Ganoderma antler、Ganoderma tsugae铁螯合能力为44.8%～67.7%[17]，所以GCTL1可能是灵芝中螯合铁的一个关键成分。

有关GCTL1抗氧化的机理尚不清楚。图8是GCTL1的结构示意图[8]。在其结构中，3位碳上有一个活波氢，可以给出一个质子，苷元结合的糖基上的羟基也可能提供质子，参与清除自由基的作用。另外3位的羟基和11位的羰基可能与金属离子发生络合作用。但具体的抗氧化机理还需要进一步进行研究。

图8 GCTL1的结构Fig.8 Structure of GCTL1

3 结 论

对从灵芝发酵液中分离获得的GCTL1的抗氧化作用进行研究。研究表明，GCTL1具有清除超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢自由基，DPPH自由基的作用，另外其还有螯合铁离子及还原力的作用，其清除超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基、过氧化氢自由基的清除率的半抑制质量浓度(IC50)分别为：0.247、0.197、0.09、0.279mg/mL；GCTL1的还原力为0.5和铁螯合力为50%的质量浓度分别是0.425、0.180mg/mL，而且在一定质量浓度范围内具有剂量依赖效应。与典型的抗氧化剂VC和BHT相比，GCTL1的总体抗氧化能力更好，因而是一种潜在的新型抗氧化剂。由于氧自由基与生物机体的很多疾病有关，如心血管疾病、炎症、肿瘤等，与衰老也密切相关，因此深入研究GCTL1的抗氧化作用具有重要的应用价值。

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Assessment of in vitro Antioxidant Activity of a Triterpenoidal Saponin from Ganoderma lucidum Fruit Bodies

CUI Yue-hua1，ZHANG Ke-chang2
(1. College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

To assess the in vitro antioxidant activity of a triterpenoidal saponin from Ganoderma lucidum, named GCTL1, GCTL1 was tested for its abilities to scavenge superoxide anion, hydroxyl, DPPH and hydroxyl peroxide free radicals, reducing power and ferric-chelating capacity and was compared with BHT and vitamin C, synthetic antioxidants. GCTL1 had interesting antioxidant effect. The IC50values for scavenging superoxide anion, hydroxyl, DPPH and hydroxyl peroxide were (0.247 ± 0.05), (0.197 ± 0.002), (0.09 ± 0.02) mg/mL and (0.279 ± 0.04) mg/mL, respectively, and the concentrations for achieving 0.5 reducing power and 50% ferric-chelating capacity were (0.425 ± 0.01) mg/mL and (0.180 ± 0.04) mg/mL. All these antioxidant properties were dependent on concentration varying in a certain range. Collectively, our findings demonstrate that GCTL1 is better antioxidant than BHT and vitamin C.

Ganoderma lucidum；triterpenoidal saponins；antioxidant activity；scavenging activity

Q946.83

A

1002-6630(2010)19-0049-05

2010-01-25

扬州大学博士科研启动基金项目

崔月花(1971—)，女，讲师，博士，研究方向为发酵工程。E-mail：yhcui@yzu.edu.cn